【摘 要】
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肌醇1,4,5-三磷酸受体（Inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R）是细胞内一种普遍存在的Ca2+通道,介导Ca2+从内质网释放,Ca2+作为细胞信号转导中的第二信使,广泛调控细胞内多种反应过程。禽类蛋壳主要由Ca CO3大量沉积而成,钙化壳是构成禽类蛋壳的主要结构,蛋壳品质影响蛋的储存、运输和孵化,已经逐渐成为制约养禽业发展的主要因素。因此,通过改善蛋
【基金项目】
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国家自然科学基金《IP3Rs通道调控蛋鸭蛋壳品质的效应机制研究》（31760663）》；
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肌醇1,4,5-三磷酸受体（Inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R）是细胞内一种普遍存在的Ca2+通道,介导Ca2+从内质网释放,Ca2+作为细胞信号转导中的第二信使,广泛调控细胞内多种反应过程。禽类蛋壳主要由Ca CO3大量沉积而成,钙化壳是构成禽类蛋壳的主要结构,蛋壳品质影响蛋的储存、运输和孵化,已经逐渐成为制约养禽业发展的主要因素。因此,通过改善蛋壳品质来提高生产和经济效益已成为家禽育种者和养殖生产者亟待解决的问题。但目前有关IP3Rs对鸭子宫上皮细胞增殖、胞内Ca2+浓度和离子转运相关基因的调控作用与机制的研究鲜有报道。基于此,本研究构建IP3Rs基因shRNA干扰载体,利用Fluo-3/AM钙离子荧光标记法检测鸭子宫上皮细胞内Ca2+浓度,CCK-8法检测鸭子宫上皮细胞的增殖情况,利用RT-qPCR法检测10个离子转运相关基因和4个细胞增殖相关基因的表达量。本试验取得如下结果:1.成功培养鸭原代子宫上皮细胞,转染IP3Rs基因干扰载体48 h后,成功筛选出对IP3Rs基因干扰效率最佳的shRNA干扰载体,IP3R1基因干扰效率最佳的载体是IP3R1-717,IP3R2基因干扰效率最佳的载体是IP3R2-2389,IP3R3基因干扰效率最佳的载体是IP3R3-777,转染干扰载体IP3R1-717、IP3R2-2389、IP3R3-777后IP3R1、IP3R2和IP3R3基因表达量极显著低于NC对照组（P＜0.01）,且干扰效率分别达到了70%、67%、70%,可用于后续试验。2.本研究证实了IP3Rs基因表达沉默显著抑制鸭子宫上皮细胞内Ca2+释放,导致细胞内Ca2+浓度相对增加,且IP3Rs基因shRNA干扰载体共转染组比单转染组对Ca2+浓度的影响更加显著。鸭子宫上皮细胞内Ca2+浓度相对升高不同程度地影响10个离子转运相关基因的表达,其中与鸭子宫上皮细胞内Ca2+浓度显著相关的基因中除SCNN1G基因是细胞质膜Na+通道外,IP3R1、IP3R2、IP3R3、TRPV6、ORAI1、ATP2B1、RYR2、ATP2A2和SLC8A1均是与Ca2+转运相关的基因。表明,鸭子宫上皮细胞内IP3Rs基因表达下调会影响细胞内Ca2+稳态,进而改变钙转运相关基因m RNA的表达水平。3.IP3Rs基因表达沉默后,CCK-8法检测鸭子宫上皮细胞增殖情况,结果显示,无论是单转染或共转染组,与NC对照组相比均促进了细胞的增殖。说明鸭子宫上皮细胞内IP3Rs基因表达沉默引起细胞内Ca2+浓度上升对细胞的增殖具有促进作用。通过RT-qPCR检测转染IP3Rs基因干扰载体48 h时4个细胞分裂周期相关基因的表达量,结果发现,转染组均极显著高于NC对照组（P＜0.01）,表明沉默IP3Rs基因的表达促进细胞增殖的同时,细胞增殖相关基因的表达量也会随之升高以维持细胞的增殖状态。细胞增殖相关基因表达量与细胞OD值相关性分析结果显示,CDCA2、CCND1、CCNE1、CDK6表达量与OD值呈显著正相关（P＜0.05）,有的组甚至达到了极显著水平（P＜0.01）,证实了CDK6、CCND1、CCNE1和CDCA2在细胞增殖过程中发挥重要作用。综上可知,IP3Rs基因表达沉默后会抑制鸭子宫上皮细胞内Ca2+浓度释放,导致细胞内Ca2+浓度上升,影响Ca2+转运相关基因的表达,并促进细胞的增殖,进而影响与细胞增殖相关基因的表达。
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