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目的恶性实体肿瘤治疗是临床医生面临的挑战性课题,由于肿瘤转移,使手术、化疗和放疗等传统治疗方法对晚期肿瘤的疗效有限,所以需要具有创新性的肿瘤治疗方法。而且新的方法应对肿瘤细胞有更好的选择性,同时又不会与现有常用的治疗方法相拮抗。复制选择性溶肿瘤腺病毒(Replication-selective oncolytic Adenovirus,RSOA)是肿瘤治疗领域中一种新的具有广阔应用前景的治疗方法。这种病毒通过基因改造后,可以选择性的在肿瘤细胞中复制并杀伤细胞,而在正常细胞中不复制或复制很低。与常规化放疗相结合已显示其明显的安全性和有效性,而单独使用RSOA疗效甚微。肿瘤细胞内基因特有的改变及其与腺病毒相互作用的分子信号传导通路是影响RSOA抗肿瘤效果的关键因素。通过一系列肿瘤细胞对复制选择性溶肿瘤腺病毒敏感性的筛选,发现DARPP-32在病毒杀伤敏感和不敏感细胞中的表达有差异,推测其可能影响病毒杀伤肿瘤。DARPP-32(Dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein)是多巴胺和环磷酸腺苷调节的磷蛋白。DARPP-32有两种形式的表达产物:DARPP-32和t-DARPP,均定位于细胞质,属于磷酸酯酶抑制剂1家族。DARPP-32是参与神经元慢突触传导及调控细胞内多种生物分子磷酸化状态的核心蛋白,是唯一具有PKA和PP1(蛋白磷酸酶1)双重抑制作用的分子。t-DARPP与DARPP-32相比,只缺少第34位苏氨酸磷酸化位点,不具有PP1抑制作用,但仍具有PKA抑制作用。近期研究发现DARPP-32和t-DARPP在胃癌细胞中有持续的高表达,其作用和机制不明。本研究的目的是检测DARPP-32在人胰腺癌中表达情况,利用细胞转染,Westernblot(Western免疫印迹)和病毒杀伤实验等研究t-DARPP蛋白是否影响病毒杀伤肿瘤效应。该研究实验中所用的病毒是复制溶肿瘤腺病毒。方法1.免疫组织化学检测,观察DARPP-32在人胰腺癌中的表达情况。2.双酶切(HindⅢ,EcoRⅠ)和基因测序鉴定pcDNA3.1(+)-t-DARPP重组质粒。t-DARPP基因的长度为525bp。3.细胞转染(脂质体转染法):将构建成功的含有t-DARPP的pcDNA3.1(+)表达载体导入不含此基因的胰腺癌细胞系(PATU8988T)使其表达t-DARPP蛋白。4.RT-PCR检测细胞目的基因mRNA的表达。引物如下:t-DARPP-32引物片段全长289bp5′TGCGCTGGCTCAGTCTCCTT 3′5′GGCCTGGTTCTCATTCAAATTGCT 3′5.Western blot在蛋白水平上检测细胞转染是否成功。6.病毒杀伤实验:利用CCK-8法比较复制溶肿瘤病毒对含有和不含t-DARPP蛋白的胰腺癌细胞系(PATU8988T)的杀伤力有无差别。对数据进行单因素方差分析,线性趋势性检验和配对t检验。采用统计软件SPSS13.0分析。结果1.免疫组织化学结果分析:DARPP-32基因在人胰腺癌中的表达率为30%。2.t-DARPP基因正确插入pcDNA3.1(+)载体中。3.RT-PCR检测到长度为289bp的目的片段。4.Western blot结果显示,转染pcDNA3.1(+)-t-DARPP重组质粒后的PaTu8988T细胞系稳定表达t-DARPP蛋白。5.t-DARPP蛋白可以增强复制溶肿瘤腺病毒杀伤胰腺癌细胞系PaTu8988T的敏感性。结论1.DARPP-32基因在人胰腺癌中的表达率为30%。2.t-DARPP蛋白影响病毒杀伤肿瘤细胞,可增强复制溶肿瘤腺病毒杀伤胰腺癌细胞系PaTu8988T的敏感性。