在全世界范围内,恶性肿瘤是最重要的死亡原因。约40%的胃癌病例发生在中国。在我国,胃癌是常见癌症第2位和恶性肿瘤死因第3位。胃癌具有恶性程度高,预后差等特点。尽管近年来胃癌的死亡率已有显著的下降,但胃癌的五年生存率依旧很低。因此,早期诊断与早期治疗是提高患者生存质量、降低死亡率的有效途径。目前,胃癌的手术、化疗、放疗、靶向等常规治疗的发展遇到了瓶颈。因此,为了更准确地进行诊断和预后评估,寻找新的、具有更高灵敏性和特异性的肿瘤标志物成为当前的关键问题。B细胞特异性莫洛尼小鼠白血病病毒结合位点-1(B-cell specific moloney leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)是在哺乳动物中发现的第一个PcG基因家族成员。人类Bmi-1基因定位在10号染色体短臂(10p11.23),包括10个外显子和9个内含子。该基因全长约3.4kb,编码分子量为36.8 kDa的蛋白,由326个氨基酸组成。人类和小鼠Bmi-1基因编码的产物氨基酸序列高度同源。Bmi-1蛋白的氨基端为RING指结构域,具有转录调节作用;中间为“螺旋–转角–螺旋–转角–螺旋–转角基序”结构,为DNA结合结构域,与转录抑制有关;羧基端为PEST序列,与细胞内快速降解有关;氨基端高度保守的RING指结构,与其他RING指蛋白形成异源二聚体,再与其他成分相互结合,抑制其靶基因的转录。Bmi-1蛋白还包含2个核定位信号。Bmi-1在转录水平和转录后水平具有重要的调节作用。MicroRNA(miRNA)是由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子,参与转录后基因表达调控。人类约有1/3的基因受miRNA调控,每个miRNA可有多个靶基因,而一个靶基因也可受控于多个miRNA,这种复杂的调节网络使miRNA和基因的关系紧密联系在一起。MiRNA在调节基因功能方面发挥重要作用,如细胞增殖、凋亡、分化、代谢等,与肿瘤的形成亦有较大的关系。每个miRNA可有多个靶基因,而一个靶基因也可受控于多个miRNA,这种复杂的调节网络使miRNA和基因的关系紧密联系在一起。MiRNA在调节基因功能方面发挥重要作用,如细胞增殖、凋亡、分化、代谢等,与肿瘤的形成亦有较大的关系。许多miRNA被报道于肿瘤细胞系及临床肿瘤组织样本异常表达,部分miRNA参与肿瘤发生的抑制作用,另一部分可诱导或促进肿瘤的发生和发展。此外,还有一部分miRNA起着致癌和抑癌的双重作用。某些恶性肿瘤中,多种miRNA均可靶向作用调控Bmi-1 mRNA。如miR-15在卵巢癌中可直接下调Bmi-1的表达。Bmi-1作为一种癌基因或许能促进恶性肿瘤的发展。但Bmi-1在胃癌发生发展的具体作用尚不明确。胃癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程。本课题围绕Bmi-1在胃癌中的表达、对胃癌细胞生物学行为的作用及其调控机制展开,首先针对Bmi-1在恶性肿瘤表达对患者预后的判断价值开展荟萃分析,并在此基础上开展以下实验研究:(1)Bmi-1表达与胃癌患者临床特征及预后的相关性;(2)胃癌中miR-15a的表达水平及与Bmi-1表达的相关性;(3)miR-15a调控Bmi-1对胃癌细胞生物学行为的作用机制。第一部分Bmi-1在恶性肿瘤的表达对患者预后判断价值的荟萃分析目的:Bmi-1在多种恶性肿瘤中存在异常表达,并可作为患者的一项预后标志物。在此,我们进行了荟萃分析,以评估Bmi-1在恶性肿瘤的表达对患者预后的作用。方法:通过搜索Pubmed,Embase和Cochrane图书馆,这个三个数据库中有关Bmi-1在肿瘤中表达与预后的临床实验(最后的搜索时间为2017年12月)。数据检索和入选文献质量评估由两位作者各自独立完成。Bmi-1阳性或高表达是根据文献提供的临界值定义。通过χ~2检验(评估P值)和计算I~2统计量,评估统计学异质性。结果:本研究共纳入60篇文献,61项研究。共纳入来自十余个国家的8460例各种恶性肿瘤患者。研究质量的平均评分6.5分。亚组分析表明,Bmi-1高表达与各种肿瘤的不良预后显著相关(HR=1.80,95%CI:1.55~2.09,P<0.001)。在种族亚族分析中,Bmi-1高表达在中日韩患者中均是一项不良预后因素(HR=2.02,95%CI 1.74~2.35,P<0.001);而与高加索人种(HR=1.15,95%CI 0.80~1.67,P=0.448)或其他国家患者(HR=1.51,95%CI 0.69~3.32,P=0.305)的OS无显著相关性。Bmi-1高表达与多种肿瘤的总生存期(overall survival,OS)较短相关,包括胃癌(HR=1.57,95%CI 1.31~1.89,P<0.001)、食管癌(HR=1.50,95%CI 1.07~2.08,P=0.019)、肺癌(HR=1.76,95%CI 1.29~2.41,P<0.001)、宫颈癌(HR=2.81,95%CI 2.28~3.46,P<0.001)、结直肠癌(HR=2.42,95%CI 1.83~3.21,P<0.001)及其它肿瘤(HR=2.09,95%CI 1.49~2.92,P<0.001)。而与头颈部鳞癌(HR=1.45,95%CI 0.90~2.34,P=0.128)、乳腺癌(HR=1.02,95%CI 0.64~1.61,P=0.936)和肝癌(HR=1.64,95%CI 0.66~4.05,P=0.238)患者的OS无显著相关性。在两项乳腺癌研究中,Bmi-1高表达提示预后较好。入选文献研究的异质性与出版时间(P=0.560)和肿瘤类型(P=0.334)无关,不存在显著的发表偏倚。结论:Bmi-1高表达与胃癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、结直肠癌等恶性肿瘤肿瘤的不良预后有关,而与头颈部鳞癌、乳腺癌和肝癌患者的OS无显著相关性。总之,Bmi-1对恶性肿瘤预后判断的意义不一致,需通过较大样本进一步分析。第二部分Bmi-1表达与胃癌患者临床特征及预后的相关性目的:Bmi-1在多种恶性肿瘤中表达异常,并可作为一种肿瘤预后标志物。然而,Bmi-1对恶性肿瘤预后判断的意义不一致,本研究拟通过352例胃癌及癌旁组织芯片进行验证。方法:通过免疫组化方法在大样本高密度肿瘤组织芯片中检测Bmi-1在352名胃癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达,结合TCGA数据库的分析结果,应用多种统计学方法分析了Bmi-1表达情况与患者临床病理特征及预后的相关性。结果:在352名胃癌患者的组织芯片中,Bmi-1蛋白存在于恶性肿瘤细胞的细胞核及细胞质中。Bmi-1在胃癌组织的表达水平显著高于配对癌旁正常胃组织(P<0.001)。TCGA数据库资料统计结果提示胃癌组织中Bmi-1 mRNA的表达水平也显著高于配对癌旁正常胃组织(P<0.001)。Bmi-1表达水平与其它临床病理特征均无显著相关性(P>0.05);Bmi-1高表达、肿瘤体积较大(≥5cm)、病理分级程度较高(Ⅲ~Ⅳ级)、肿瘤浸润较深(较晚的T分期)、淋巴结转移或转移较多(>70%或较晚的N分期)、远处转移(M1)、AJCC分期较晚均为胃癌患者的不良预后因素;Ⅰ~Ⅱ期胃癌患者的Bmi-1表达水平较Ⅲ~Ⅳ期患者显著升高(P=0.021)。Ⅱ期胃癌患者的Bmi-1表达水平较III期患者显著升高(P=0.035);Bmi-1蛋白高表达胃癌患者的中位生存期显著长于Bmi-1低表达的患者(43.5月vs.24.5月,P<0.05);淋巴结转移患者中Bmi-1高表达患者的中位生存期显著长于Bmi-1低表达患者(P=0.007)。结论:Bmi-1表达水平可作为胃癌一项独立预后因素,胃癌组织中Bmi-1的高表达提示预后较好。第三部分胃癌组织中异常表达的miRNA与Bmi-1表达水平的相关性目的:鉴于第一部分与第二部分中Bmi-1表达对胃癌预后判断价值的不一致,我们试图寻找调控Bmi-1表达的上游miRNA,检测候选miRNA和Bmi-1在胃癌组织中的表达,分析两者的相关性。方法:通过初筛查找胃癌中可能表达异常的miRNA(包括miR-15a、miR-16和miR-200c)作为候选miRNA。获取21块胃癌组织及配对癌旁正常组织,应用实时PCR检测了胃癌组织芯片中miR-15a的表达水平;应用荧光原位杂交技术检测100例胃癌组织芯片中miR-15a的表达水平。通过免疫组化方法检测了胃癌组织与组织芯片中Bmi-1蛋白表达水平。应用统计学方法分析其差异性,进而确定本研究的靶miRNA为miR-15a。通过原位杂交实验和免疫组化方法检测靶miRNA和Bmi-1在胃癌组织及配对癌旁正常组织中的表达,并分析两者表达的相关性。结果:miR-15a在胃癌组织的表达较配对癌旁正常组织显著降低(P=0.0239),而miR-16和miR-200c在胃癌组织和配对癌旁正常组织中的表达水平并无显著差异;胃癌组织中miR-15a的高表达对应Bmi-1蛋白的低表达;胃癌组织芯片之中,Bmi-1表达水平和miR-15a表达水平均呈负相关(P=0.034,R2=0.22,r=-0.48)。结论:胃癌组织中,Bmi-1表达水平和miR-15a表达水平呈负相关。第四部分miR-15a调控Bmi-1对胃癌细胞增殖和侵袭的作用机制目的:探讨miR-15a在胃癌细胞中对Bmi-1的调控机制,及Bmi-1对胃癌细胞生物学行为的作用。方法:选择两种胃癌细胞株,分别转染入miR-15a;构建了Bmi-1 3’UTR载体,在胃癌细胞株中验证Bmi-1是miR-15a的靶点。通过细胞增殖测定验证外源性Bmi-1对胃癌细胞增殖的影响。通过transwell方法验证外源性Bmi-1对胃癌细胞侵袭的影响。结果:1.胃癌细胞株中,证实miR-15a通过与Bmi-1 m RNA直接结合负性调控Bmi-1蛋白表达,Bmi-1是miR-15a的靶分子。胃癌细胞株AGS和SNU-5转染miR-15a后增殖速率显著下降(P<0.001);2.外源性miR-15a可通过下调胃癌细胞株中Bmi-1蛋白表达从而降低胃癌细胞侵袭能力。结论:在胃癌中,Bmi-1是miR-15a的靶点,受其负性调控。Bmi-1促进胃癌细胞的增殖及侵袭能力,这种促进作用可能涉及多种机制。低表达Bmi-1的胃癌细胞增殖较慢,而高表达的细胞则增殖较快,从而对化疗更敏感,化疗疗效更好。而化疗疗效好和预后较好相关。因此本课题中Bmi-1高表达患者生存时间较长的原因可能是因为这部分患者对化疗更敏感。