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第一章 氧化型ATM对乳腺癌CAFs细胞增殖的调控作用及其机制研究目的：探讨氧化型ATM对乳腺癌CAFs增殖的调控作用及其机制。方法：(1)以课题组前期构建的永生化乳腺癌NFs和CAFs为模型,采用MTT法、生长密度实验、流式细胞分析和蛋白印迹实验检测乳腺癌CAFs的异常增殖行为。(2)蛋白印迹、细胞免疫荧光和免疫组化实验检测乳腺癌NFs和CAFs中p-ATM(s1981)、ATM和γH2AX(s139)的蛋白表达量。各种ROS抑制剂处理乳腺癌CAFs, DCFH荧光探针实验检测乳腺癌CAFs中ROS含量改变,蛋白印迹实验检测CAFs细胞ATM氧化活化的改变。(3)应用ATM特异抑制剂KU60019和siRNA技术抑制乳腺癌CAFs中氧化型ATM功能,观察氧化型ATM功能缺失对乳腺癌CAFs增殖的作用。(4)用KU60019和NAC同时处理乳腺癌CAFs,分析NAC对ATM功能缺失所致CAFs增殖缺陷的影响。(5)使用KU60019处理CAFs,蛋白印迹实验检测KU60019对MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信号通路活性的影响。采用U0126、LY294002和XAV939抑制剂处理CAFs,检测MEK-MAPK.PI3K-AKT和WNT信号通路失活对CAFs增殖的作用。(6)用KU60019、U0126、LY294002和XAV939处理CAFs,蛋白印迹检测ATM功能、MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信号通路失活对CAFs中GSK3β、 β-catenin和c-Myc蛋白表达的影响。同样条件下,ChIP实验检测处理前后CAFs细胞β-catenin转录活性的改变。运用siRNA技术敲除CAFs中c-Myc,观察c-Myc敲除对CAFs增殖的影响。结果：(1)MTT实验、细胞密度实验、流式细胞分析和蛋白印迹实验的结果显示,与NFs相比,CAFs增殖速度快、生长密度大、S期细胞比例高以及细胞增殖正向调控蛋白表达升高,这说明乳腺癌CAFs具有异常增殖表型。(2)与NFs相比,CAFs中p-ATM (s1981), ATM和p-AKT (s473)蛋白表达升高,γH2AX (s139)蛋白表达无变化。在各种ROS抑制剂处理下,只有NAC、DPI和rotenone能降低CAFs细胞中的ROS水平和p-ATM (s1981)蛋白表达量。(3)与对照相比,KU60019抑制或ATM基因敲除明显抑制CAFs增殖速率、降低CAFs生长密度、减少CAFsS期细胞比例、抑制细胞增殖正向调控蛋白表达,这说明氧化型ATM具有促CAFs增殖作用。(4)与溶剂对照相比,NAC能逆转KU60019处理所致CAFs细胞OS,但仅能小部分逆转KU60019所导致的CAFs增殖缺陷。(5)蛋白印迹实验结果显示,KU60019显著抑制CAFs中ERK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信号通路活性。与溶剂对照相比,U0126、LY294002和XAV939单独或联合处理抑制CAFs增殖。(6)蛋白印迹实验结果表明,KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能增强GSK3β激酶活性,抑制β-catenin和c-Myc蛋白表达。ChIP实验结果显示,KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能阻断P-catenin转录活性。与对照相比,c-Myc敲除能抑制CAFs增殖。结论：(1)与乳腺癌NFs细胞相比,乳腺癌CAFs具有异常增殖表型。(2)乳腺癌CAFs中存在非DSBs依赖性ATM氧化活化现象。(3)氧化型ATM促乳腺癌CAFs增殖。(4)氧化型ATM氧化还原维持功能对乳腺癌CAFs增殖调控作用有限。(5)氧化型ATM主要通过增强ERK-MAPK, PI3K-AKT和WNT信号通路活性促进乳腺癌CAFs细胞增殖。(6)β-Catenin/c-Myc轴介导氧化型ATM促CAFs增殖功能。第二章 氧化型ATM对低氧乳腺癌CAFs细胞EMR的调控作用及其机制研究目的：研究氧化型ATM对低氧乳腺癌CAFs细胞EMR的调控作用及其机制。方法：(1)分析乳腺癌CAFs/NFs mRNA表达芯片,挖掘乳腺癌CAFs细胞中异常表达的能量代谢相关基因,qRT-PCR法验证。与常氧NFs相比,葡萄糖消耗速率、乳酸产生速率、蛋白印迹、线粒体活性和电镜等实验检测低氧对CAFs EMR的影响。(2)与溶剂对照相比,探讨抗氧化剂NAC和线粒体呼吸链复合酶体Ⅲ抑制剂rotenone对低氧CAFs EMR的影响。(3)以溶剂为对照,蛋白印迹实验检测NAC和rotenone对低氧CAFs ATM氧化活化的作用。用KU60019处理CAFs,探讨氧化型ATM功能缺失对低氧CAFs EMR的影响。(4)采用磷酸化蛋白质组学技术和生物信息学技术筛选低氧CAFs氧化型ATM下游潜在的能量代谢相关底物。结果：(1)mRNA芯片和qRT-PCR实验结果显示,在乳腺癌CAFs中,许多糖酵解基因表达上调,很多OP基因表达下调,能量代谢相关信号通路异常活化。与常氧NFs相比,低氧CAFs的葡萄糖消耗速率和乳酸产生速率明显升高,促能量代谢蛋白表达上调,线粒体活性被严重抑制,线粒体嵴和数量显著减少。这表明低氧诱导CAFs细胞具有典型的EMR表型。(2)ROS水平检测、蛋白印迹和代谢实验结果表明,NAC和rotenone抑制低氧CAFs细胞ROS升高和EMR。(3)蛋白印迹实验的结果显示,NAC和rotenone抑制低氧CAFs ATM的氧化活化。蛋白印迹和代谢实验的结果表明,氧化型ATM功能丧失抑制低氧乳腺癌CAFs EMR。这表明,氧化型ATM具有促进低氧CAFs EMR功能。(4)磷酸化蛋白质组学实验和生物信息学分析结果显示,低氧CAFs细胞氧化型ATM下游具有许多新的潜在的能量代谢相关底物。结论：(1)低氧诱导乳腺癌CAFs产生典型的EMR表型。(2)线粒体来源的ROS介导低氧乳腺癌CAFs细胞EMR。(3)线粒体来源的ROS氧化活化低氧乳腺癌CAFs细胞ATM激酶。氧化型ATM促进低氧乳腺癌CAFs EMR。 (4)氧化型ATM可能通过磷酸化新的能量代谢相关底物调控低氧乳腺癌CAFs EMR。