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温度是限制植物生长、发育及产量的重要环境因子。当植物遭受温度逆境胁迫时,生物膜系统被认为是最先受到伤害的部位。植物体内膜脂不饱和脂肪酸含量越高,膜脂相变温度就越低,低温抗性就越强。反之,则相变温度越高,高温抗性越强。ω-3脂肪酸去饱和酶是不饱和脂肪酸合成途径中催化16:2(7,10)或18:2(9,12)转化为16:3(7,10,13)或18:3(9,12,15)的关键酶。其含量的变化能改变膜脂中脂肪酸的组成,尤其是三烯脂肪酸的水平,进而影响相变温度,改变植株对温度胁迫的抗性。本研究从番茄叶片中分离到番茄叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因。表达模式和功能分析表明,该基因的表达受低温、水分、盐胁迫诱导,受高温胁迫抑制。抑制该基因表达可提高番茄植株的耐热性,而过量表达该基因则增强番茄植株的耐冷性。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,先通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因的中间片段,然后采用RACE的方法分别克隆到5′片段和3′片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。该基因全长为1683 bp,ORF为1308 bp,编码435个氨基酸,分子量约为50 kD。将其在GenBank注册,注册号为AY157317。2.同源序列比较发现,番茄叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶基因的序列与马铃薯、甜椒、烟草、芥菜型油菜的质体型ω-3脂肪酸去饱和酶基因同源性很高,分别为96%、92%、89%和85%。同时,进化分析表明,该基因聚类到叶绿体型FAD7类ω-3脂肪酸去饱和酶,因此将其命名为LeFAD7基因。该酶蛋白为膜蛋白,有三个跨膜信号区, N端有一段叶绿体转运肽。结构同源性分析表明LeFAD7有四个序列保守的结构域,其中后三个保守区富含组氨酸,是维持其膜结合类酶特性所必须的。3. Southern杂交结果表明,LeFAD7基因在番茄基因组中是单拷贝的,是编码番茄ω-3脂肪酸去饱和酶多基因家族中的一员。Northern杂交结果表明LeFAD7基因在不同器官中呈非特异性表达,在叶绿素含量高的组织中表达量较高,尤以幼嫩叶片中表达量最高,且受发育时期的调控。同时,该基因在所有生长温度范围内(4-40℃)均有表达,受低温、水分(20% PEG)、盐(200 mM NaCl)胁迫诱导,且在三种胁迫下叶片内源表达量呈现先升高,然后降低,接着再升高的双峰表达模式,高温胁迫抑制其表达。4.将获得的LeFAD7基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转入番茄中,通过5‰的卡那霉素筛选,获