鱼腥藻PCC7120裂合酶相关基因的启动子及表达调控的研究

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大部分蓝藻藻胆蛋白的合成需要裂合酶的催化,alr0617编码的CpcS1与all5339编码的CpcT1均被证明具有裂合酶催化活性。而与cpcS1和cpcT1同源性很高的cpcS2(all5292)和cpcT2(alr0647)均被证实无裂合酶的催化活性,并且这两个基因只在缺氮的条件下表达,正常情况下不表达。   为了进一步研究alr0617基因的生理功能,通过分子生物学基因敲除的方法,构建△alr0617缺失突变体。从鱼腥藻PCC 7120基因组中调出alr0617上下游同源臂及基因片段,用壮观霉素(Spectinomycin,简称Sp)替换目的基因片段,与含有蔗糖致死基因sacB的pRL271载体连接,转化HB101/pRL623大肠杆菌菌种。通过结合转移的方法将构建好的缺失质粒导入鱼腥藻细胞中,通过抗性和蔗糖双重筛选转化子。由于蓝藻基因组含有多个拷贝,经PCR方法检测,证明得到的菌株为单交换的突变株。与野生型藻细胞相比,△alr0617对抗缺氮的压力与野生型相当,但是对蔗糖较为敏感。   本文还对cpcS2(all5292)和cpcT2(alr0647)启动子进行了研究。通过找到这两个基因的有转录活性的启动子片段以进一步对这两个基因编码的蛋白进行定位研究。研究方法是截取cpcS2(all5292)和cpcT2(alr0647)两个基因5’端上游可能包含有启动子转录活性的不同长度的DNA片段,与绿色荧光蛋白基因gfp体外构建融合载体,通过结合转移的方法导入到鱼腥藻细胞,通过对GFP的追踪观察,初步确定有转录活性的启动子片段。结果显示,在正常的培养基BG11及缺氮培养基BG110中,cpcS2基因上游1100bp片段都没有启动子活性,2000bp片段有弱的启动子活性;cpcT2基因上游680bp、1300bp与2600bp可能的启动子片段中,1300bp启动子与2600bp的启动子片段活性较强,680bp则较弱。BG110缺氮培养基中各种藻细胞都产生大量的异型胞,但是异型胞中没有GFP的表达。
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