酪醇是芳香族氨基酸酪氨酸的衍生物,广泛存在于橄榄油、红酒、清酒等发酵制品中,是一种天然的抗氧化剂,具有抗氧化、抗衰老、调节代谢、减少色素沉积、预防细胞损伤等多重生物活性和药用价值。传统的酪醇获取方法为植物提取法和化学合成法,但是这两种方法存在成本高、产率低、造成环境污染等缺点。微生物合成法是一种利用基因工程技术来构建微生物细胞工厂以生产目标产物的方法,通常具有生产周期短、转化效率高、环境友好等特点,具有良好的发展潜力。酿酒酵母Saccharomycescerevisia是国际公认的安全菌株,其生理代谢旺盛;生理、遗传等各方面研究都比较深入;遗传操作方法简单、成熟,因此是极有潜力的微生物细胞工厂。在酿酒酵母中,经过糖酵解途径(Glycolytic pathway,EMP)的中间代谢产物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)和戊糖磷酸途径(Pentose phosphate pathway,PPP)的中间代谢产物赤藓糖-4-磷酸(erythrose 4-phosphate,E4P)的缩合,从而进入莽草酸途径(Shikimate pathway),合成酪氨酸等芳香族氨基酸,其中E4P的量是已知限制因素。目前,利用微生物发酵的方法来合成酪醇的研究还相对较少。木糖是木质纤维素的主要成分之一,在自然界中,是继葡萄糖之后第二丰富的糖,发酵木糖以生产各种产品对于木质纤维素类原料的充分利用有重要意义,但是野生型酿酒酵母不能直接代谢木糖。在本课题组前期工作中,通过异源引入木糖代谢途径,增强PPP,以及适应性驯化等工作,获得了木糖代谢效率较高的重组酿酒酵母菌株。从代谢途径上看,木糖代谢首先进入产E4P的PPP,且Crabtree效应(即葡萄糖的存在引起EMP通量过大,PEP迅速转化为丙酮酸并溢出,形成乙醇大量积累的现象)较弱都更有利于酪醇的合成,但是暂时未见酿酒酵母以木糖为碳源进行酪醇生产发酵的研究被报道。基于以上研究背景,本课题主要以获得发酵木糖高产酪醇的酿酒酵母为目标,分别进行了酪醇高产菌株以及酪醇高产菌株筛选系统的构建工作,具体研究内容和相关展望如下:1.利用木糖生产酪醇的酿酒酵母重组菌株的构建和优化。在实验室前期构建的可利用木糖的重组酵母菌株的基础上,我们引入香芹芳香醛合酶基因aas和大肠杆菌醇脱氢酶基因adh组成的酪醇合成途径,发酵结果显示,重组菌株酪醇产量比对照菌株提高了 219.9%,表明该途径的引入可促进酪醇的生产。分别以葡萄糖为碳源和以木糖为碳源的发酵结果显示,当以木糖为碳源时,重组菌株酪醇得率为5.13 mg g-1,比以葡萄糖为碳源时高95.3%,该结果证实了相比葡萄糖,以木糖为碳源更有利于酪醇生产的设想。之后,我们在重组菌株中利用点突变解除反馈抑制(ARO4K229L、ARO7G141S)、蛋白融合定向中间代谢产物的走向(TAL1-ARO4K229L),用过表达酵母内源ADHH6基因代替大肠杆菌adh基因等策略均可不同程度的提高酿酒酵母的酪醇产量,其中,过表达内源ADH6基因的菌株产酪醇能力最强,达到172.33 mg L-1。随后,我们分别测试了表达大肠杆菌醛还原酶基因yahK和巴西固氮螺菌脱羧酶基因ipdC组成的途径、强化内源脱羧酶基因ARO10的途径对酵母产酪醇的影响。结果显示,过表达酿酒酵母内源的脱羧酶基因ARO10的菌株产酪醇能力最强,达到170.63 mg L-1。这些有利策略还需要进一步的组合工作,以获得高产酪醇的重组酿酒酵母菌株。2.酪醇高产菌株筛选系统的初步构建。在这部分工作中,我们利用RNAseq技术分析了酵母转录组对酪醇的响应。结果显示,共有34个(21个上调基因、13个下调基因)显著响应酪醇的基因,经过荧光定量PCR验证筛选出两个基因CHA1和PDR5表达水平随酪醇浓度增高逐渐增强。之后,将荧光蛋白基因置于这两个基因的启动子(PCHA1、PPDR5)控制下表达,并测试培养环境中外源添加不同浓度酪醇的菌株荧光强度,结果显示,菌株荧光强度可随着酪醇浓度的升高而增强,酪醇高产菌株筛选系统初步被建立。综上,本论文工作构建了利用木糖生产酪醇的重组酿酒酵母菌株,尝试了多种策略的有效性,各种策略尚需组合,菌株的生产性能还有待进一步提高。同时,我们构建了高产酪醇菌株筛选系统,在未来的工作中,将继续优化该系统,并利用该筛选系统在理性或非理性改造菌株后,根据荧光强度变化简便、快速的筛选出酪醇产量高的转化子。