肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor，hTNF)是由激活的巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子，其最显著的活性特征是可以在体内或体外特异性的杀伤多种肿瘤细胞。是一种有潜在应用价值的抗肿瘤、抗病毒感染以及免疫调节生物制剂。TNF的临床研究曾在在许多国家展开，但因其全身用药毒副作用太大而限制了其临床应用。但利用提高肿瘤组织TNP-α浓度的技术和应用基因工程手段制备高效低毒TNF-α突变体呈现出较好的应用前景。重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)是本中心通过基因工程方法，去除TNF-α分子氨基端7个氨基酸残基，并且把8、9、10和157位氨基酸突变构建的一种改构人TNF。rmhTNF比天然TNF体外杀伤L929细胞的活性增加1000倍左右，毒性降低3倍。器官或组织血管特异性的分子异 萝四军医大学项士申位论文质性是一个普遍的现象。肿瘤转移首选器官依赖于肿瘤细胞与该器官血管床特定分子相互作用。通过噬菌体展示肽文库技术可以筛选出与特定器官特异性结合的多肽。GFE－l是应用噬菌体多肽展示肽文库筛选出的一种可以在肺组织特异性富集的多肽，含有13个氨基酸（C哩CVRQCPERC），它可 vx vx G田三肽与靶位结合。G田J 与肺结合的受体 MDP（membraneipeptidase）是一个55上Da的肺微血管细胞表面蛋白，是一个包含在谷腴甘肽、Leukotriene D。及 p－内酞胺抗生素代谢过程中的细胞表面锌金属蛋白。MDP以二硫键形成二聚体。主要分布于肺小血管内皮及肾近球小管刷状缘区。应用特异性多肽作为导向载体具有分子量，J、，构建简单等特点。它有更低的免疫源性；可以选择性地与肿瘤血管相结合，在体内较容易到达肿瘤组织深部，主要与靶向蛋白功能重要的结构域结合，能更好的发挥“弹头分子”杀伤作用。我们利用基因工程方法，将GFEl肽融合在inhTNF－a的氨基端，期望其能特异性在肺组织富集，以达到治疗肺部肿瘤的目的。我们人工合成了编码GFE－l的寡核旮酸片断，与rlnhTNF基因连接后，克隆入 pGEM3zf卜）质粒；序列分析表明，合成片断成功的插入 rmLhTNF的氨基端。将融合基固克隆APBV220表达载体中，在大肠杆菌中得到高效表达，表达量占菌体总蛋白量的30％。以部分可溶形式存在，将裂菌上清经过硫酸铬分段盐析后，QSepharose FF阴离子交换柱层析和 SPSepharose FF阳离子交换柱层析，可获取纯度＞87％的蛋白，蛋白回收率为2．58％。在此基础上用 L929细胞在体外证明了其生物学活性并对其进行了体内分布的研究。体内分布实验证实其在肺部富集水平高于肝、肾组织。且呈时间依从性。免疫组化结果表明 GFE－l－inhTNF V以与肺血管及支气管内膜特异结合。