论文部分内容阅读
目的：南板蓝根来源于爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia (Nees) Bremek的干燥根茎及根,其性寒,味苦。归心、胃经。具清热解毒,凉血消斑的功效；为我国南方常用中药材,然而国内外有关南板蓝根多糖(Baphicacanthus cusia polysaccharide, BCP)的研究报道较少。本实验对南板蓝根多糖超声波提取工艺进行系统化研究,对其进行分离、纯化,并进一步对纯化组分进行初步的药理实验研究。为南板蓝根多糖开发出相应的食品、药品提供理论依据。方法：采用Box-Beknken设计优化超声波辅助提取南板蓝根多糖工艺。首先采用单因素实验,对提取时间、提取温度、水料比等实验因素进行考察,在单因素实验结果的基础上进行3因素3水平的响应面设计,然后按照响应面设计条件进行试验操作,计算二次线性拟合方程,得出最佳理论提取条件,最后根据最佳提取条件进行3次平行提取实验,比较理论值与实际值的差异,验证理论模型是否符合实际实验结果。继而在最优提取条件下提取南板蓝根多糖。之后对提取所得粗多糖用DEAE-纤维素-52层析柱按极性进行梯度洗脱,并将不同洗脱浓度分离出的洗脱液分类收集、浓缩、醇沉、透析及浓缩干燥,再采用Sephadex G-100层析柱进一步纯化多糖；用苯酚-硫酸法测南板蓝根粗多糖及纯化组分的总糖含量、考马斯亮蓝法测南板蓝根粗多糖及纯化组分的蛋白质含量、硫酸-咔唑法测南板蓝根粗多糖及纯化组分的糖醛酸含量、氯化钡-明胶法测南板蓝根粗多糖及纯化组分的硫酸基含量,以评价南板蓝根多糖的基本理化性质。将最终分离所得纯化多糖与粗多糖进行体外抗氧化试验,考察其清除超氧阴离子自由基、还原力测定及金属离子螯合能力,以评价其抗氧化活性。再用二甲苯诱导小鼠耳肿胀和醋酸所致小鼠腹腔通透性增加实验,考察BCP对模型小鼠的耳肿胀度和腹腔通透性的影响,以评价南板蓝根多糖的抗炎活性。最后再用MTT法测定南板蓝根多糖对HepG2细胞生长的抑制作用,以评价南板蓝根多糖的体外抗肿瘤活性。成果：1.采用响应面法优化超声波辅助提取南板蓝根多糖工艺,在单因素实验结果的基础上进行3因素3水平的响应面设计,然后按照响应面条件进行试验操作,得出二次线性拟合方程为Y=-16.28050-0.31210X1+0.36565X2+1.07600X3-0.009X1X2-0.0096X1X3-0.0022X2X3+0.021160X12-0.00021X22-0.012440X32,回归系数R2=0.9248>0.9,表明该模型相关度好。根据所得到的模型,预测最优工艺条件：BCP最佳提取工艺为提取温度60℃,提取时间35min,水料比24.5:1(m:v,mL/g),南板蓝根多糖的提取率理论值为8.43%,而其实际为8.37±0.36% (n=3),实际值与理论值较为接近,由此可知,响应面法优化超声辅助提取南板蓝根多糖工艺得到的提取条件参数可靠。2.南板蓝根粗多糖用DEAE-纤维素-52层析柱初步分离出两个组分,分别是去离子水洗脱得B1及0.3 rnol/mL NaCl洗脱得到的B2组分,采用葡聚糖凝胶色谱柱对2个初步分离出的组分(B1和B2)进一步分离纯化分别得到南板蓝根多糖纯化产物BCP-1和BCP-2。3.粗BCP及其2个不同纯化组分(BCP-1、BCP-2)的基本理化性质如下：①粗BCP中多糖含量为79.07%,在纯化后,多糖含量显著提高。BCP-1中多糖含量为89.71%,BCP-2中多糖含量为92.56%。②粗BCP中蛋白的含量为0.34%,纯化后的组分BCP-1中蛋白质含量为0.23%,BCP-2中蛋白质含量为0.26%。纯化后多糖中蛋白质含量所有降低。③南板蓝根粗多糖中糖醛酸含量为1.60%。纯化后的组分BCP-1中糖醛酸含量为2.24%,BCP-2中糖醛酸含量为2.57%。④南板蓝根粗多糖中硫酸基含量为1.72%。纯化后的组分BCP-1中硫酸基含量为0.76%,BCP-2中硫酸基含量为4.74%,BCP-2中硫酸基含量显著高于粗BCP和BCP-1。4.对粗BCP及其纯纯化组分BCP-1、BCP-2进行抗氧化研究,结果如下：①粗BCP、BCP-1、BCP-2均具有良好的清除超氧阴离子自由基的活性,其中BCP-2清除除超氧阴离子自由基能力最强。在浓度为2000μg/mL时,粗BCP、BCP-1、BCP-2、Vc的清除率为66.3%、84.8%、87.4%、80.3%。②粗BCP及其纯化组分的还原能力大小顺序为：Vc>BCP-2>BCP-1>粗BCP。其中BCP-2与Vc在浓度低于120gg/mL时还原力相近；在浓度高于120μg/mL时,Vc的还原力逐渐高于BCP-2；BCP-1的还原能力略高于粗BCP。③粗BCP及其纯化组分的鳌合Fe2+的能力在40μg/mL至2000μg/mL之间均程增长趋势,在这浓度范围内BCP-2鳌合Fe2+的能力最强,粗BCP鳌合Fe2+的能力最弱。Vc及BCP-1鳌合Fe2+的能力在浓度低于120μg/mL时与粗BCP相近。在浓度高于120μg/mL后,Vc、BCP-1鳌合Fe2+的能力渐渐高于粗BCP相近。在浓度低于400μg/mL,BCP-2鳌合Fe2+的能力明显高于Vc和BCP-1。在浓度高于400μg/mL,三者的鳌合Fe2+的能力趋近相同。5.粗BCP对二甲苯诱导小鼠耳肿胀和醋酸所致小鼠腹腔通透性增加具明显抑制作用。6.粗BCP在体外可有效的抑制人肝癌细胞的活性和细胞增殖。结论：以上研究可知,响应面法优化超声波辅助提取BCPT艺参数稳定、可靠；BCP及其纯化组分抗氧化效果明显；BCP具有一定的抗炎、抗肿瘤活性。BCP具有良好的生物活性,具有深入研究的实际意义,为进一步开发出相应药品及功能保健品供新的思路。