研究背景由于创伤、感染或肿瘤外科手术等病理性因素造成临床出现大量骨缺损病例,所以大段节段性骨缺损的重建仍是一个重要的临床问题。当前临床治疗方法主要包括骨材料移植(自体移植,同种异体移植或异种移植)、不同生物材料植入或骨传输生长方法(Ilizarov技术),但是这些技术均存在一定的缺陷和不足。骨组织工程虽然在将来有可能取代自体骨移植,但目前必须解决如何同时为大块骨支架材料内细胞供应氧和营养物质的问题。有效的血液循环和神经支配对于骨组织的生长、发育、创伤修复都具有重要的作用。在体内实验中,运用各种不同方法促使所植入材料与宿主体内各种支配因素(血管或神经)结合将有助于解决这一问题。本研究采用显微外科方法将血管束、感觉神经束植入组织工程骨修复大段骨缺损,观察组织工程骨成骨及其血管化和神经化,探讨组织工程骨内血液供应和神经支配的重建与成骨的关系,为其在临床的应用提供一定的理论依据。研究目的初步观察血管束、感觉神经束植入对组织工程骨内血管神经重建的影响,探讨血管束、感觉神经束植入组织工程骨促成骨的可能机制。实验方法1.5～6月龄新西兰大白兔42只,体重2.0～2.5kg,随机分为3组,每组14只。从兔髂前上嵴穿刺抽取骨髓并分离获得骨髓基质干细胞进行扩增、诱导分化为成骨细胞,与带侧槽的β-磷酸三钙(购自法国贝奥路公司)复合构建组织工程骨;所有动物均制造左侧后肢股骨1.5cm大段节段性骨缺损,采用微型钢板固定,按照骨缺损植入物不同进行分组:A组,组织工程骨组,单纯植入组织工程骨;B组,血管束植入组,在植入组织工程骨的同时将股血管束游离适当距离后植入组织工程骨侧槽;C组,感觉神经束植入组,在植入组织工程骨的同时将隐神经游离适当长度后锐性切断并植入组织工程骨的侧槽。2.影像学观察及组织学观察。术后4、8、12周每组分别取4只动物,对骨缺损区行X线检查后行影像学评分。处死动物取标本行4%多聚甲醛固定,10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙后石蜡包埋,连续做5μm厚纵行切片,行HE及Masson染色,观察组织工程骨成骨特点。3.对各组标本行CD34(血管内皮细胞标记物)的免疫组化染色。用图像分析软件(Image Pro-Plus 6.0 Media Cybernetics,美国)测定染色阳性新生血管的数量。利用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学处理,用3×3析因设计方差分析对处理因素和时间的主效应和交互效应做统计,若有显著性差异则用单向方差分析(One-way ANOVA)对同一时间点各组间用LSD法行多重比较分析,P＜0.05具有统计学差异。4.墨汁灌注观察血管生成。术后12周各组取2只实验动物行墨汁灌注,制备冰冻切片观察组织工程骨血管生成情况。5.对各组标本行突触素(SY)及神经微丝200(NF200)(神经总标记物)的免疫组化染色。用图像分析软件(Image Pro-Plus 6.0 Media Cybernetics,美国)测定阳性染色的积分光密度值(IOD值)(IOD值与免疫表达强度成正比)。利用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学处理,用3×3析因设计方差分析对处理因素和时间的主效应和交互效应做统计,若有显著性差异则用单向方差分析(One-wayANOVA)对同一时间点各组间用LSD法行多重比较分析。6.银染色观察支配神经重建。取各时间点各组标本行常规银染色,观察组织工程骨神经重建情况。结果1.影像学评分对各组骨缺损区X线检测的影像学评分行3×3析因设计方差分析显示,各时间点间、各组间评分有统计学差异(F分别为216.001,51.485,均为P=0.000);时间与分组之间交互效应显著(F=3.617,P=0.017)。用One-way ANOVA和LSD法统计分析发现,各组内在4、8、12周均有统计学差异(P＜0.05),随着时间增加,各组评分均显著增加;在各时间点,各组组间有统计学差异(P＜0.05),两两比较B组与C组无显著性差异(P＞0.05),两组评分均高于A组(P＜0.05)。2.组织学观察术后4周血管束植入组在材料外周可见较多血管样结构及大量围绕血管出现的新生骨,材料内部可见材料孔隙内新生血管明显,血管周围纤维组织出现一定程度的胶原表达及成骨;神经束植入组的材料外周血管生成不及血管束植入组明显,但仍可见大量新生骨,材料内部与血管束植入组相似,而且部分区域可见软骨向骨组织转化;组织工程骨组的材料外周血管生成及成骨一般,仍可见较多的炎症细胞存在,材料内部未见明显血管生成及成骨。术后8周各组材料均有一定降解,各组材料外周及周围骨痂成骨增加,血管束植入组与感觉神经束植入组骨痂成熟优于组织工程骨组;血管束植入组与感觉神经束植入组材料内部可见骨岛形成,组织工程骨组材料内部成骨较少。术后12周时血管束植入组的材料外周可见明显血管样结构,血管周围的材料降解明显,大部分被新生骨替代,软骨向类骨质和骨组织转化区域更为广泛、明显,材料内部可见大量新生骨生成;神经束植入组的血管生成及成骨明显增加,也可见大量类似成骨区域;组织工程骨组的材料外周血管生成及成骨明显增加,但材料内部的材料降解程度及新生骨成熟度明显不如其它两组。3.血管内皮细胞标记物CD34的免疫组织化学观察对植入物区新生骨组织内CD34标记新生血管数量行3×3析因设计方差分析显示,各时间点间、各组间有统计学差异(F分别为222.578,189.181,均为P=0.000);时间与分组之间交互效应显著(F=2.964,P=0.038)。用One-way ANOVA和LSD法统计分析发现,在4周、8周、12周各组间均有统计学差异(P＜0.05),表达以B组＞C组＞A组。A组、B组和C组在各时间点组内有统计学差异(P＜0.05),表达均以8周最高。4周时,A、C两组CD34标记血管位置大致相同,多在材料外周及周围骨痂,材料内部有少量血管存在,但B组在在材料内部可见明显新生血管。随着时间增加,三组的新生血管数量在8周观察点最高,12周时可见血管走向及结构更加粗大,成熟。4.墨汁灌注观察结果术后12周,血管束植入组材料内部可见明显血管结构,血管数量较多,而且血管形态粗大、成熟,血管结构与成骨区相邻。神经束植入组材料内部血管数量比血管束稍差,形态中等,较成熟。组织工程骨组材料内部血管数量少,血管形态一般,欠成熟。5.神经总标记物突触素及神经微丝200的免疫组化观察对植入区新生骨组织内突触素(SY)表达的IOD值行3×3析因设计方差分析显示,各时间点间、各组间有统计学差异(F分别为130.722,103.523,均为P=0.000);时间与分组之间交互效应显著(F=4.867,P=0.004)。用One-way ANOVA和LSD法统计分析发现,在4、8周各组组间均有统计学差异(P＜0.05),表达以B组＞C组＞A组;在12周时B组与C组无显著性差异(P＞0.05),两组均高于A组(P＜0.05)。A组在各时间点组内有统计学差异(P＜0.05),表达以4周＞8周＞12周;B组在8、12周无显著性差异(P＞0.05),均低于4周表达(P＜0.05),C组与B组在各时间点变化一致。4周时,B、c两组SY表达位置大致相同,多在新生骨周围及软组织间隙,A组表达不明显。随着时间增加,三组SY的表达量均出现一定程度减少,在8周和12周时,SY的分布位置以骨间隙和血管周围最多。对植入区新生骨组织内神经微丝200(NF200)表达的IOD值行3×3析因设计方差分析显示,各时间点间、各组间有统计学差异(F分别为152.848,146.814,均为P=0.000);时间与分组之间交互效应显著(F=5.575,P=0.002)。用One-wayANOVA和LSD法统计分析发现,在4周各组组间均有统计学差异(P＜0.05),表达以B组＞C组＞A组;在8、12周时B组与C组无显著性差异(P＞0.05),两组均高于A组(P＜0.05)。A组、B组和C组在各时间点组内有统计学差异(P＜0.05),表达以4周＞8周＞12周。NF200表达与SY表达大致相同:4周时,B、C两组NF200表达位置多在新生骨周围及软组织间隙。但A组表达不明显。随着时间增加,三组在组织工程骨内的表达量总体表达减少。在8周和12周时,SY的分布位置以骨间隙和血管周围最多。6.银染色观察结果银染结果显示,在4周时,各组组织工程骨内神经纤维结构多出现在外周,材料内部仅在组织空隙内可见神经纤维样结构,形态较差。在8周时,在新生骨组织间隙内可见大量银染色的神经纤维,以感觉神经束植入组与血管束植入组最为明显,染色的神经纤维结构清晰,交错存在。在12周,可在骨组织内见形态良好的神经纤维结构,在血管腔周围同样可见明显银染纤维。结论1.在骨缺损修复早期,植入血管束的组织工程骨组与植入感觉神经束的组织工程骨组均能促进骨缺损修复,而两组之间无明显差别。2.在骨缺损修复早期,植入血管束的组织工程骨组与植入感觉神经束的组织工程骨组均能促进组织工程骨血液循环重建,而且前者重建效果优于后者。3.在骨缺损修复早期,植入血管束的组织工程骨组与植入感觉神经束的组织工程骨组均能促进组织工程骨支配神经重建,而两者之间总体无明显差别。4.新生血管与支配神经在术后12周均出现不同程度减少,提示骨缺损修复初期(4～8周)在组织工程骨血管与神经重建过程中具有重要意义。5.组织工程骨内血液循环与支配神经重建在骨缺损修复过程中具有重要作用。