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棉花是世界上重要的油料作物。棉籽油既可用作食用行业,又可用于制备生物柴油及其它油脂化工品。然而,棉籽油中含有较多的不饱和亚油酸(C18:2Δ9,12,约59%),容易发生酸败变质。因此,在棉籽食用油的加工过程中,一般需经过氢化来增加其饱和度,但该过程又会产生对人体健康有害的反式脂肪酸。此外,与大豆和油菜等普通油料作物相比,棉籽油中还含有较高水平（约25%）的棕榈酸（C16:0）,这也是限制棉籽油营养价值的主要因素。棕榈油酸（C16:1Δ9）等单不饱和ω-7脂肪酸是一类健康有益型脂肪酸,具有独特的营养功效和广泛的工业用途,也是制备高抗氧化性和抗冷性优质生物柴油的最佳脂肪酸。然而,棉花、大豆和油菜等普通油料作物中几乎不能积累ω-7脂肪酸。因此,改善棉籽油的脂肪酸成分和比例,开发高品质棉籽油已成为棉花遗传育种的主攻目标之一。本文以陆地棉（Gossypium hirsutum）为试材,通过系统解析棉花种子油脂和脂肪酸成分的时空分布和发育调控特征,全基因组鉴定控制种子油脂单不饱和脂肪酸（C16:1Δ9或C18:1Δ9）合成的酰基-ACP-Δ9脱氢酶（GhSAD）和决定16C与18C脂肪酸比例的β-酮脂酰-ACP合酶Ⅱ（GhKASⅡ）家族成员及其表达谱,分别沉默内源GhKASⅡ和过表达16:0-ACP特异的猫爪草酰基-ACP-Δ9脱氢酶（MucACP-Δ9d）表征其对棉籽脂肪酸成分等影响,再以共表达方式同时沉默GhKASⅡ和过表达MucACP-Δ9d基因,以期在棉籽中组装一条ω-7脂肪酸生物合成途径,获得富含ω-7脂肪酸的优质棉籽油新种质。本研究丰富了植物种子油脂合成的调控理论,建立了可用于普通油料作物种子富集ω-7脂肪酸的代谢工程新策略。主要研究结果如下:1.检测了4个不同品种的陆地棉种子油脂成分,发现棕榈油酸（C16:1Δ9）含量（%总油脂）均极低（<1%）。进一步对棉籽不同发育阶段的胚和胚乳中油脂成分及积累水平检测,发现脂肪酸成分及含量具有时空差异性。尽管在成熟后的棉花种子中胚乳消失（无胚乳种子）,但在成熟前各发育阶段的胚乳中均能合成积累棕榈油酸,且含量远高于胚,随着种子的发育,胚乳中棕榈油酸的含量也呈现出先升高后降低的趋势,并在开花后25天（Days After Flowering,DAF）时达到最高值（16.95 Mol%）。然而,在不同发育阶段的胚中棕榈油酸含量均不足1%,但是油酸（C18:1Δ9）的含量却显著高于胚乳（p<0.01）。这预示着棉花发育胚乳中存在催化16:0-ACP生成16:1Δ9-ACP的酰基-ACP-Δ9脱氢酶,而在发育胚中行使功能的酰基-ACP-Δ9脱氢酶具有催化18:0-ACP生成18:1Δ9-ACP的活性。2.通过分析陆地棉的全基因组数据,我们共鉴定到17个棉花酰基-ACP-Δ9脱氢酶（EC:1.14.19.2,GhSAD）蛋白家族成员,分别命名为GhA-SAD1GhA-SAD9和GhD-SAD1GhD-SAD8。蛋白质保守结构区域氨基酸序列比对显示,决定催化底物特异性的8个氨基酸残基在10个棉花GhSAD成员和具有典型18:0-ACP活性的SAD酶蛋白（例如,蓖麻RCSAD1）完全相同。其余6个棉花GhSAD成员（GhA-SAD5/6/7和GhD-SAD5/7/8）中这8个氨基酸残基序列变异性较大,明显不同于已知具有18:0-ACP活性的SAD,而与具有16:0-ACP活性的SAD酶蛋白（例如,拟南芥AtADD2）相似。3D蛋白结构模拟表明,这8个氨基酸残基位于酶蛋白底物结合腔的底部并靠近二铁催化中心的位置,两类底物特异性SAD底物结合腔空间构型不同。据此,我们推测有10个棉花GhSAD成员可能是18:0-ACP特异的,而另外6个GhSAD成员可能对16:0-ACP底物有选择性。3.对预测的6个具有16:0-ACP活性的棉花GhSAD成员（GhA-SAD5/6/7和GhD-SAD5/7/8）启动子序列分析显示,这6个GhSAD基因启动子区均含有胚乳特异表达的顺式元件,预示着它们可能在发育胚乳中特异表达,进而催化16:0-ACP生成16:1Δ9-ACP。组织表达分析发现,这6个GhSAD基因在棉花根、茎、叶和花等器官中表达量较低,而在发育中期（1020 DAF）的胚珠中表达量较高。进一步对这6个GhSAD基因的表达谱进行分析,发现GhA-SAD6和GhD-SAD8在15-25 DAF的胚乳中表达最高,而GhA-SAD5和GhA-SAD7的转录本则倾向于在胚组织中少量富集。可见棉花GhSAD成员的表达有组织特异性,其功能亦有差异。4.通过烟草瞬时表达系统和TAG合成缺陷型酵母功能互补实验,进一步证明异源超表达GhA-SAD6和GhD-SAD8均能导致宿主细胞产生高水平的棕榈油酸（C16:1Δ9）,且GhA-SAD6活性强于GhD-SAD8。相反,异源超表达GhA-SAD5和GhA-SAD7的宿主细胞可积累较多的油酸（C18:1Δ9）。这表明,GhA-SAD6和GhD-SAD8对16:0-ACP有较强的底物特异性,在棉花发育胚乳中负责催化棕榈油酸的合成,而GhA-SAD5和GhA-SAD7对18:0-ACP有底物选择性,负责催化发育胚乳中油酸的合成。5.β-酮脂酰-ACP合酶Ⅱ（KASⅡ,EC:2.3.1.179）在质体内催化16:0-ACP生成18:0-ACP,直接决定了植物体内16C和18C脂肪酸的比例。为增加棉籽油中16:0-ACP的积累,进而为16:0-ACP特异的SAD提供更多的底物用于16:1Δ9-ACP的合成,我们依据GhKASⅡ基因编码序列的保守区设计RNAi干扰靶位点,构建GhKASⅡ基因沉默载体（GhKASⅡ-RNAi）,并利用农杆菌介导法进行棉花遗传转化。分子检测表明,转基因棉花株系GhKASⅡ基因表达量显著低于对照株系。GhKASⅡ沉默的转基因棉籽油中棕榈酸（C16:0）含量较野生型提高了约13%,相应的硬脂酸、油酸、亚油酸分别减少了1.33%、4%和5.4%。转基因株系棉籽的总油脂、淀粉和可溶性糖含量以及发芽率等农艺性状未出现不良表型。6.前期我们从富含ω-7脂肪酸的猫爪草（Macfadyena unguis-cati）种子中分离到一个可高效催化16:0-ACP生成C16:1Δ9-ACP的酰基-ACP-Δ9脱氢酶（MucACP-Δ9d）基因。通过构建该基因的种子特异性表达载体（Gly-MucACP-DSRB）,利用农杆菌介导的遗传转化体系,获得了在棉花种子中特异表达MucACP-Δ9d的转基因株系。生化测试显示,MucACP-Δ9d转基因棉籽中的棕榈油酸（C16:1Δ9）含量从野生型的0.47%上升至6.62%,其碳链延伸产物顺式-11-十八碳烯酸(C18:1Δ11)也提高了约1.5%。相应地,棕榈酸和亚油酸含量明显减少。与对照相比,转基因棉籽总含油量亦增加了约4%,然而其它生理生化指标（如淀粉和可溶性糖含量）和27℃下的发芽率则没有明显变化。此外,转基因种子在低温（17℃）条件下的发芽率明显高于野生型,表明能合成ω-7脂肪酸的转基因棉花种子耐逆性显著改善。7.进一步在发育棉花种子中,同时沉默内源GhKASⅡ和过表达外源MucACP-Δ9d,获得的转基因棉花种子油脂中ω-7脂肪酸含量从不足1%提高到了19.6%。其中,棕榈油酸（C16:1Δ9）和顺式-11-十八碳烯酸(C18:1Δ11)含量分别提高至14.62%和4.98%。相应地,亚油酸含量减少13.1%,棕榈酸含量减低2.58%。这种双基因修饰的棉花工程株系其他农艺性状亦未呈现负效应。很显然,沉默内源GhKASⅡ阻断了质体内18:0-ACP生成,使16:0-ACP含量增加。过表达16:0-ACP特异的MucACP-Δ9d酶蛋白则催化更多的16:0-ACP生成16:1Δ9-ACP,最终实现ω-7脂肪酸的富集。同时沉默内源KASⅡ和超表达16:0-ACP特异的SAD,在棉花发育种子中成功组装了富集ω-7脂肪酸生物合成途径的策略亦可用于对其它油料作物油脂品质的遗传改良。