黑色素是一类带负电荷的疏水性生物大分子物质,通常是由酚类或吲哚类物质聚合而形成的复合体。它是自然界中最为丰富的天然色素,广泛存在于动物、植物和微生物中。研究表明,黑色素能提高生物生存、竞争的能力,因此,它的普遍存在被认为是进化过程中生命与环境长期相互适应的结果,对各种生命过程中黑色素形成机理及其生物学功能的研究几十年来一直都是科学研究的热点。另一方面,生物体合成的黑色素被证明具有抗氧化,抗辐射,抗病毒感染,可激活免疫系统,可结合重金属离子、结合药物等许多重要的生理功能,具有广泛的开发应用价值。绝大部分细菌来源的黑色素都属于真黑色素或者脓黑色素。真黑色素又被称为多巴黑色素（DOPA melanin）,由酪氨酸酶催化酪氨酸经L-多巴形成多巴醌,后者再进一步通过复杂的自氧化过程形成色素。脓黑色素又被称为尿黑酸黑色素（HGA melanin）,由羟苯丙酮酸双加氧酶（4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）催化底物羟苯丙酮酸形成尿黑酸,后者再通过自氧化和聚合过程形成色素。中间气单胞菌WS是本实验室从东湖中分离得到的一株高产黑色素的菌株,该菌的特点在于色素形成能力强和形成色素时间短。该菌所产黑色素已被证明在作为生物杀虫剂,紫外线保护剂及防晒型化妆品方面均有应用开发潜力,其全基因组序列测定工作已经完成。前期工作发现,采用HPLC技术可以在WS菌株的培养液中检测到中间产物多巴,这说明该菌可以形成多巴黑色素（DOPA melanin）。根据合成多巴色素的酪氨酸酶的特点,对该酶进行纯化。再针对纯化得到的蛋白的N端氨基酸序列来设计简并引物,也曾克隆到该菌的疑似酪氨酸酶的编码基因,tyrA。但后续的研究却发现tyrA的敲除突变株在色素表型上与野生型菌株并无明显改变,说明tyrA并非控制WS菌株黑色素合成的关键基因。为此,本文采用转座子随机插入突变的方法再次对WS菌株中与色素形成有关的基因进行筛选,以期揭示该菌黑色素形成的分子机制。为建立适合在WS菌株中进行转座子随机插入突变的实验体系,首先对无突变热点的Tn5系列转座子载体PUTKm2和pTnMod-OGm进行改造。将Tn5终端反向重复序列内部的抗性基因替换成WS菌株敏感的氯霉素抗性基因,并破坏掉载体上原有的氨苄青霉素抗性基因,改造后的载体分别命名为pTnCm和pTnMod-O-Cm。通过二亲本接合的方法将上述2个载体分别导入WS菌株中,检测发现pTnMod-O-Cm在WS菌株细胞中具有自我复制能力,不利于后续实验；而导入的pTnCm质粒在WS中无复制性,且其上的Tn5转座子是随机地插入到突变株的基因组上的,因此最终选择该质粒用于筛选WS菌株的色素形成相关基因。由于细菌黑色素具有扩散性,无法使用普通平板来筛选产黑能力改变的突变株。因此,我们将氨苄青霉素和氯霉素平板上长出的接合子再逐个点种到含固体培养基的96孔板上,对菌株的产黑能力进行单独观察。最终从大约2万个接合子中筛选获得了14个黑色素产量下降的突变株,命名为Ml-M14；其中突变株M10和M13基本失去了形成色素的能力。对这14个突变株的生长情况进行检测,发现相同培养条件下M12和M14的菌体量明显下降,说明它们色素形成能力下降的表型很可能是由于转座子打断了与菌体生长相关的基因,而不是色素形成相关的基因。其余12个突变菌株的生长能力与野生型菌株WS基本一致,因此它们的色素合成相关基因很可能被转座子中断从而导致其色素产量的降低。通过Tail-PCR结合转座子挽救的方法,从上述12个突变株中最终确定了其中的9株菌的转座突变基因,其中2株突变株（M5,M6）涉及phhA基因的突变,3株突变株（M1,M9,M11）可能涉及tyrB基因的突变,而它们都是与尿黑酸代谢有关的基因。但遗憾的是,经过多次努力,依然无法确定基本丧失了产黑能力的M10和M13菌株的转座子插入位点。通过HPLC技术对WS菌株和突变株M10、M13各个培养时期的培养液进行检测,结果在WS菌株培养液中同时检测到了多巴和尿黑酸的存在,而从M10、M13的培养液中只检测到了多巴。这说明除多巴色素外,WS菌株可能也形成脓黑色素,并且后者是该菌所产色素的主要成分。这是首个气单胞菌可能合成脓黑色素的实验证据。结合文献中有关尿黑酸代谢途径的研究报道,从WS菌株基因组上找到了可能参与脓黑色素合成的相关基因,并通过基因定向敲除和基因回补实验验证了它们的功能：1)phhA基因编码的是苯丙氨酸羟化酶,其可催化苯丙氨酸形成酪氨酸,后者参与黑色素的合成。在WS菌株中对phhA基因进行敲除导致了色素产量的降低,其表型与突变株M5,M6十分类似。而phhA基因的回补,或往培养基中补加酪氨酸则可显著恢复phhA基因突变株的产黑能力,这证实了对phhA基因功能的推测；2)tyrB和aspC这2个基因编码的均是芳香族氨基酸氨基转移酶,在WS菌株中这2种蛋白共同催化底物酪氨酸形成羟苯丙酮酸。但是tyrB基因的编码产物在该过程中可能起着主要作用,对该基因的单敲除会导致菌株色素减产。aspC单敲除菌株的色素产量基本无变化,而tyrB和aspC基因双敲除菌株基本不形成黑色素；3)hppD基因编码的是羟苯丙酮酸双加氧酶,该酶可催化羟苯丙酮酸形成尿黑酸,该基因敲除后,突变株完全失去了产黑能力,也不再能从培养液中检测到中间产物尿黑酸的存在；并且向突变株中回补携带hppD基因的质粒可使其色素产量得到恢复。这说明hppD是WS菌株中控制脓黑色素形成的关键基因。在此值得一提的是,在M10和M13菌株中上述基因经检测均与出发菌株WS一致,并未发生转座子插入突变,说明该菌可能还存在其它调控脓黑色素形成的因素,有待今后工作的继续验证。对数据库中公布了全基因组序列的几株气单胞菌菌株进行分析,发现上述脓黑色素合成相关基因不仅在具有产黑表型的菌株中普遍存在,而且也存在于不具备黑色素形成能力的嗜水气单胞菌（A. hydrophila）中。将具有产黑能力的中间气单胞菌WS菌株、杀鲑气单胞菌（A. salmonicida AB98041, A. salmonicida KACC14791）,及不具有黑色素形成能力的嗜水气单胞菌A. hydrophila XS91-4-1的hppD基因克隆后在大肠杆菌中进行异源表达,重组菌株均表现出了产黑表型；RT-PCR分析也证实脓色素合成通路中的相关基因在这些气单胞菌菌株中均可转录,说明气单胞菌确实普遍具有形成脓黑素的能力。嗜水气单胞菌之所以不表现产黑表型,很可能是因为该菌存在其它未知的色素合成调控机制。通过HPLC检测这些菌的中间产物,发现中间产物HGA只存在于合成黑色素的Aeromonas 菌中。该结果也表明脓黑色素可能是气单胞菌属中合成的主要色素。此外,研究发现克隆来自杀鲑气单胞菌A. salmonicida AB98041和A. salmonicida KACC 14791的hppD基因的重组大肠杆菌只在22℃培养下才可以形成黑色素,在30℃培养下则基本无色素的形成,这种表型与众所周知的杀鲑气单胞菌色素形成特点是一致的。这是首次通过实验揭示杀鲑气单胞菌只在低温培养条件下才能形成黑色素的分子机制：该菌的羟苯丙酮酸双加氧酶具有温敏特性,在30℃或以上温度就会失去酶活。气单胞菌广泛分布于陆地和水生环境中,该属中的一些种是人类和动物的重要条件致病菌,例如产色素的杀鲑气单胞菌和不形成黑色素的嗜水气单胞菌。本文以中间气单胞菌WS菌株为研究重点,揭示了该属细菌中黑色素形成的分子机理,扩展了对原核生物黑色素形成机制多样性的认识。这不仅丰富了对细菌黑色素形成机制的认识,而且在应用上也将有助于今后采用分子遗传学手段改进菌株的黑色素形成能力,提高细菌来源黑色素的应用、开发水平。