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中华蜜蜂Apis cerana cerana是中国的独特蜂种,具有抗寒、抗螨、易分蜂、善于利用零星蜜源及适应性强的优良特性,在植物授粉方面发挥着非常重要的作用。其通过体表特定的嗅觉感受器中的嗅觉相关蛋白与外界环境中各种化学气味物质接触,其中气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)发挥着重要作用。而亚致死剂量下的化学物质——新烟碱杀虫剂对蜜蜂等授粉昆虫具有不同的毒性,这种毒性差异引起的蜜蜂毒害及其分子机制未得到深入解析。本研究对现有的OBP11、CSP3和ASP1这3种信息素相关蛋白与相应的配基和吡虫啉进行了较为深入的研究。利用多光谱技术研究了OBP11、CSP3和ASP1对外界气味分子及吡虫啉的结合模式。确定了OBP11与多种配基、CSP3和吡虫啉结合的关键氨基酸和主要作用力。还对温度、pH以及吡虫啉对蛋白和配基的结合影响进行了研究。主要结果如下:1.中华蜜蜂信息素相关蛋白OBP11的蛋白纯化、定点突变及配基结合机理研究。制备了AcerOBP11蛋白,并利用LC-MS/MS质谱进行了验证。通过扫描电镜和透射电镜进行了触角亚细胞定位,表明工蜂触角的多样性和AcerOBP11蛋白表达的特异性。荧光竞争实验显示,AcerOBP11在感受蜜蜂信息素与植物挥发物的行为过程中发挥双重作用。通过分子对接和定点突变,确定了Ile97和Ile140为AcerOBP11与配基结合时的关键氨基酸。圆二色谱显示,3个突变氨基酸残基对OBP11的二级结构都有影响,突变Ile97使OBP11蛋白α-螺旋增多,使蛋白变得更加紧凑,OBP11-F101G和OBP11-I140G的α-螺旋减少,蛋白结构伸展,OBP11-F101G的α-螺旋减少最多。2.中华蜜蜂信息素相关蛋白OBP11与新烟碱杀虫剂吡虫啉的结合机理研究。荧光结合和热力学实验发现,AcerOBP11与吡虫啉在不同温度下均有较强结合。在290 K到300 K的过程中,猝灭机制为动态猝灭,主要作用力为疏水相互作用和静电作用力;在300 K到310 K的过程中,猝灭机制为静态猝灭,主要作用力为疏水相互作用。在紫外吸收光谱下,AcerOBP11与吡虫啉的结合在290 K属于动态猝灭。圆二色谱结果显示,吡虫啉使α-螺旋减少,改变了蛋白的二级结构,使其变得伸展松弛。分子对接预测了AcerOBP11与吡虫啉结合过程中的关键氨基酸和氢键,Ala138贡献了氢键,Ile97、Ile140和Phe101主要贡献了能量。研究了不同温度、不同pH对AcerOBP11与HOB和9-ODA的荧光强度变化,AcerOBP11与9-ODA均不产生直接结合。AcerOBP11与HOB只有在pH 4.0的条件下有较强的直接结合,300 K到310 K时的猝灭机理为动态猝灭。3.中华蜜蜂信息素结合蛋白CSP3的蛋白纯化、定点突变及配基结合机理研究。CSP3与吡虫啉和啶虫脒均有结合,且与吡虫啉的结合强于与啶虫脒;CSP3与二者的结合均属于静态猝灭;CSP3与吡虫啉结合过程中的主要作用力为氢键和范德华力,与啶虫脒的为疏水作用力。设计了3组突变体Lys100和Phe101、Arg66、Ser6和Tyr7并制备了突变体蛋白。CSP3野生型和所有突变体蛋白与吡虫啉的猝灭机理为静态猝灭。所有突变体均参与了CSP3与吡虫啉的相互作用,且R66和S6Y7下降更为剧烈,暗示CSP3的主要作用结构位于N端。热力学结果显示,CSP3野生型与吡虫啉的主要作用力为氢键和范德华力,而CSP3m-R66G的主要作用力变为了疏水相互作用,说明R66主要在CSP3与吡虫啉作用过程中贡献了氢键。CSP3与吡虫啉结合的同步荧光显示,色氨酸是CSP3荧光强度的主要来源且在CSP3结合腔中更靠近结合位点。圆二色谱表明,3个突变体蛋白CSP3m-K100F101G、CSP3m-S6Y7G、CSP3m-R66G的α-螺旋比野生型多。吡虫啉的滴加使得所有3个突变体蛋白的α-螺旋减少,说明吡虫啉使蛋白肽链伸展。与8种小分子物质的结合表明,CSP3与DL-赖氨酸和土霉素亲和力较强。其他5种小分子物质结合也有较强结合,磺胺不结合。通过研究吡虫啉对CSP3与配基结合的影响发现,吡虫啉在低浓度下促进CSP3与HOB和土霉素的结合,在高浓度下抑制与二者的结合。而与花香物质β-紫罗兰酮和3,4-二甲基苯甲醛与DL-赖氨酸则相反,K_A呈现出与原始K_A值相比减小的趋势,表明吡虫啉对二者与CSP3蛋白结合的抑制作用。4.中华蜜蜂信息素结合蛋白ASP1的蛋白纯化及配基结合特性分析。结果表明,随着温度的升高,ASP1与吡虫啉的K_A值逐渐增大;猝灭从静态变为了动态猝灭;主要作用力均为疏水作用力。不同浓度吡虫啉作用下,ASP1与HOB的结合呈现“W”的趋势,但总体处于促进的状态。同时,发现ASP1与9-ODA在不同温度和pH下均不结合,与HOB均有结合。在与HOB结合过程中,在pH不变的情况下,300 K到310 K为静态猝灭,结合力为疏水作用力。而在同一温度下,pH值越低,表观结合常数K_A值越大,结合能力越强。