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北沙参为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根,具有养阴清肺,益胃生津的功效,可用于肺热燥咳,劳嗽痰血,热病津伤口渴等症。香豆素是北沙参中的一类主要活性成分。麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f.)Ker-Gawl的干燥块根,有养阴生津、润肺清心之功效,可用于肺燥干咳,阴虚劳嗽,喉痹咽痛等症。皂苷和高异黄酮是麦冬中两类主要的活性成分。北沙参-麦冬是临床常用的滋养肺胃之阴药对,对于二者的配伍目前仅限于药理学作用研究,并未见二者配伍的化学成分研究报道。本研究即采用HPLC-ESI-MS/MS,UPLC/q TOF-MS等现代分析技术,对北沙参-麦冬配伍前后的体内外化学成分进行了研究。第一部分 北沙参-麦冬配伍前后19种化学成分的含量变化目的:建立北沙参-麦冬合煎液中19种化学成分的HPLC-ESI-MS/MS定量分析方法,并比较两药单煎和合煎19种化学成分的含量变化。方法:采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),配有Agilent C18 column保护柱;柱温:25.0℃;流动相:乙腈(A)和0.3‰的乙酸水溶液(B);梯度洗脱程序:20%A(0-13 min),20%-95%A(13-30min),95%A(30-30.1 min);流速:1 m L/min;进样量:10μL。质谱条件ESI离子源采用正负离子切换监测模式。雾化气(GS1),40 psi;加热气(GS2),50 psi;帘气(CUR),25 psi;温度(TEM),650℃;正离子源喷射电压(Ion Spray Voltage Floating),5500 V;负离子源喷射电压(Ion Spray Voltage Floating),-4500 V;接口加热,全程通入氮气。MRM模式定量。19种被测成分的监测离子对分别为东莨菪内酯(m/z 193.1/133.1)、伞形花内酯(m/z 163.0/107.1)、花椒毒酚(m/z 203.1/147.1)、异紫花前胡内酯(m/z247.3/175.1)、水合氧化前胡素(m/z 305.2/203.1)、补骨脂素(m/z187.0/131.1)、花椒毒素(m/z 217.1/174.1)、麦冬皂苷C(m/z 851.5/393.4)、麦冬皂苷Ra(m/z 719.5/393.3)、异茴芹内酯(m/z 247.2/217.1)、佛手柑内酯(m/z 217.1/202.1)、氧化前胡素(m/z 287.1/203.1)、麦冬皂苷D(m/z 855.7/287.2)、欧前胡素(m/z 271.1/203.0)、异欧前胡素(m/z 271.1/203.0)、甲基麦冬高异黄酮A(m/z 341.1/219.1)、甲基麦冬二氢高异黄酮A(m/z343.1/135.0)、甲基麦冬二氢高异黄酮B(m/z 329.1/121.1)和麦冬黄烷酮C(m/z 354.9/192.7)。用所建立的方法对北沙参单煎液、麦冬单煎液和北沙参麦冬合煎液中的19种化学成分进行分析。结果:19种化学成分在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,相关系数R2﹥0.9991;仪器精密度RSD值均小于1.9%,批内精密度(RSD)和批间精密度(RSD)分别小于3.8%和3.6%;平均回收率范围为97.8~104.4%;稳定性、检测限和定量限均符合要求。样品测定结果表明,配伍对北沙参、麦冬中的化学成分的含量确有影响,香豆素类在北沙参-麦冬药材配伍后含量下降,麦冬甾体皂苷类和麦冬高异黄酮类在北沙参-麦冬药材配伍后含量上升。结论:本法简便、快速、专属性好,可用于北沙参-麦冬配伍前后19种化学成分的含量测定,为研究中药配伍体外化学成分量的变化提供了依据。第二部分 北沙参-麦冬配伍前后的化学成分鉴定目的:总结香豆素类、麦冬皂苷类和高异黄酮类的质谱裂解规律,建立灵敏、有效的UPLC/q TOF-MS分析方法,用于北沙参-麦冬配伍前后的化学成分的鉴定和比较。方法:采用UPLC/q TOF-MS技术对混合对照品溶液、北沙参单煎液、麦冬单煎液、北沙参麦冬合煎液和空白溶剂进行TOF-MS-IDA-8MS/MS扫描,获取全扫描质量色谱图,根据对照品的一级、二级质谱信息总结这一类化合物的质谱裂解规律。在此基础上,采用Peak View 2.0数据处理软件中的“Master View”分析化合物保留时间、精确分子质量、元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱信息,鉴定样品中的化学成分。色谱条件:Phenomenex Kinetex 2.6μC18 100A(50×3.0 mm,2.6μm);柱前连接在线过滤器;柱温为室温;流动相为0.03%甲酸水(A)和乙腈(B),梯度洗脱;流速为0.4 m L/min。进样量为2μL。结果:鉴定了北沙参中48种香豆素类化合物,麦冬中11种甾体皂苷类和27种高异黄酮类化合物,北沙参-麦冬药对中44种香豆素类、11种甾体皂苷类和32种高异黄酮类化合物,并总结了配伍前后化学成分15处不同。其中22种化合物与对照品比对可确证其化学结构,其余71种化合物通过分析元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱信息被鉴定,误差范围均在±5 ppm内。结论:本法灵敏、有效,已成功用于北沙参-麦冬配伍前后化学成分的鉴定和比较,发现北沙参麦冬配伍前后化学成分发生变化:在北沙参单煎液中已经鉴定到,而北沙参-麦冬合煎液中未能鉴定的8个香豆素类化合物;北沙参和麦冬单煎液中未鉴定到,而北沙参-麦冬合煎液中已鉴定到3个香豆素类化合物和4个高异黄酮类化合物。该研究为中药配伍物质基础研究提供了依据。第三部分 北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内的吸收组分与其代谢物鉴定目的:采用UPLC/q TOF-MS技术,鉴定并比较北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内尿液、血浆和胆汁中的代谢物,探索其活性成分的体内代谢途径。方法:1北沙参灌胃液的制备:将北沙参按照传统水煎工艺提取,加入4倍量无水乙醇沉淀,抽滤,减压除醇,用水稀释至相当于2 g/m L的原药材。麦冬灌胃液、北沙参-麦冬(1:1)灌胃液同法制备。2生物样品的采集和预处理:取12只雄性Sprague-Dawley大鼠,体重250±10 g,随机分为4组,空白组3只,北沙参组3只,麦冬组3只,北沙参-麦冬组3只,按体重以1 m L/100 g的给药量,灌胃给与大鼠,分别采集给药后72 h的尿液、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h时的血浆样品和24 h的胆汁样品,分别合并所有的尿样、胆汁和血浆样品。将合并的尿液和胆汁样品分别用3倍量的乙酸乙酯萃取,萃取3次,每次10 min。合并乙酸乙酯层,减压干燥,残渣用甲醇溶解。在合并的血浆样品中加入3倍量的乙腈,离心取上清液,氮气流吹干,加入50%的乙腈复溶。3样品分析条件:采用UPLC/q TOF-MS技术分析样品。色谱柱为Phenomenex Kinetex 2.6μC18 100A(50×3.0 mm,2.6μm);柱温为室温;流动相为0.03%甲酸水(A)和乙腈(B),梯度洗脱;高分辨质谱采用ESI源,正、负离子模式,全扫描采集,采用动态背景扣除和信息依赖采集触发二级碎片的采集,每一循环采集8个最强峰的二级质谱图。4代谢物发现和鉴定的步骤:首先结合文献,建立北沙参、麦冬中香豆素类、甾体皂苷类和高异黄酮类已知化合物的信息库。然后用Peak View2.0软件寻找主要的吸收组分。再将这些吸收组分按照结构的相似性分类,选择每类中的典型化合物。接着采用Metabolitepilot 1.5软件,对这些典型化合物进行分析,寻找尿样、胆汁和血浆样品中这些化合物的代谢物。最后根据香豆素类的裂解规律和化合物的极性,对这些代谢物的结构进行解析,推断可能的代谢产物,并比较配伍前后代谢物是否发生改变。结果:选取东莨菪内酯、异茴芹内酯、异紫花前胡内酯、紫花前胡苷、欧前胡素、水合氧化前胡素、麦冬皂苷D’、甲基麦冬高异黄酮A和麦冬黄烷酮E为代表,用Metabolitepilot 1.5软件以这些代表性的化合物为模板进行分析,寻找其代谢物,共鉴定出231种成分,主要的代谢类型有氧化、氢化、内部水解、去饱和、去甲基化和甲基化等。并且发现北沙参-麦冬配伍给药前后在大鼠体内共有136种(62种香豆素类、33种甾体皂苷类和41种高异黄酮类化合物)不同的吸收组分和代谢物。结论:本研究采用UPLC/q TOF-MS技术,成功发现和鉴定了北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内的代谢物,结果表明配伍影响了药材在大鼠体内的代谢,为中药配伍体内过程的阐明奠定了基础。