目的:1.体外细胞实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长的抑制作用及分子机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对PC3与DU145细胞生长的抑制增强作用及分子机制。2.体内动物实验探讨(1)重楼皂苷I对人去势抵抗性前列腺癌DU145裸鼠移植瘤的抑制作用及相关通路蛋白或RNA表达的影响,以了解重楼皂苷I体内抗前列腺癌机制;(2)重楼皂苷I联合恩杂鲁胺对DU145裸鼠移植瘤的抑制增强作用及相关通路蛋白或RNA表达的影响,以了解联合给药在体内抗前列腺癌的协同作用机制。方法:第一部分:1.MTT法(四甲基偶氮唑盐比色法)观察PPI对去势抵抗性前列腺癌PC3和DU145细胞的生长是否具有抑制作用及时间与剂量依赖关系;沉默LncRNA HOTAIR对PC3和DU145细胞的生长是否有抑制作用;过表达HOTAIR、EZH2、DNMT1能否逆转PPI对PC3和DU145细胞的生长抑制作用。2.流式细胞术检测PPI对PC3和DU145细胞周期的影响。3.细胞迁移实验(划痕实验)检测PPI对PC3和DU145细胞迁移能力的影响。4.细胞侵袭实验(Transwell侵袭实验)检测PPI对PC3和DU145细胞侵袭能力的影响。5.Western-blot检测不同剂量PPI、转染HOTAIR siRNA及转染HOTAIR、EZH2、DNMT1过表达质粒对PC3和DU145细胞的EZH2、DNMT1蛋白表达的影响。6.Real-Time-PCR检测PPI对PC3和DU145细胞的HOTAIR表达水平的影响。7.启动子活性(双荧光素酶报告基因检测)实验检测PPI以及转染HOTAIR过表达质粒对PC3和DU145细胞的EZH2基因启动子活性的影响。8.建立裸鼠肿瘤模型,设置对照组、重楼皂苷I组进行干预,观察裸鼠体内生物素发光信号及最终的裸鼠肿瘤大小及重量,对组织进行western-blot及Real-Time-PCR检测;观察重楼皂苷I(Polyphyllin I)对肿瘤生长抑制的效果,及对HOTAIR、EZH2、DNMT1表达水平的影响,进而从体内体外确定重楼皂苷I对去势抵抗性前列腺癌细胞的生长抑制作用。第二部分:1.MTT法观察PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞的抑制效果并分析是否具有协同作用;过表达MUC1能否逆转PPI对PC3和DU145细胞的生长抑制作用。2.流式细胞术检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞周期的影响。3.Western-blot分别检测PPI,PPI联合恩杂鲁胺,转染HOTAIR siRNA及转染HOTAIR、P65、P50、MUC1过表达质粒对PC3和DU145细胞的P65、P50、MUC1蛋白表达水平的影响。4.Real-Time-PCR检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞HOTAIR、MUC1 mRNA的表达水平的影响;转染P65及MUC1过表达质粒后对细胞HOTAIR表达水平的影响。5.启动子活性(双荧光素酶报告基因检测)实验检测PPI联合恩杂鲁胺对PC3和DU145细胞的MUC1基因启动子活性的影响;转染HOTAIR过表达质粒后对细胞的MUC1基因启动子活性的影响。6.建立裸鼠肿瘤模型,设置对照组、重楼皂苷I组、恩杂鲁胺组、重楼皂苷I(Polyphyllin I)联合恩杂鲁胺(Enzalutamide)组进行干预,观察裸鼠体内生物素发光信号及最终的裸鼠肿瘤大小及重量,对组织进行western-blot及Real-Time-PCR检测,观察重楼皂苷I(Polyphyllin I)联合恩杂鲁胺(Enzalutamide)对肿瘤生长抑制的效果,及对NF-ΚB、MUC1和LncRNA HOTAIR表达水平的影响,进而从体内体外确定重楼皂苷I联合恩杂鲁胺治疗对去势抵抗性前列腺癌细胞的生长抑制具有协同作用。结果:第一部分:1.MTT法检测细胞活力实验结果:(1)PPI对去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性及时间依赖性(P<0.05)。(2)沉默HOTAIR可使细胞活力下降,过表达HOTAIR、EZH2、DNMT1可逆转PPI对PC3与DU145细胞生长的抑制作用。2.流式细胞术检测细胞周期结果:(1)与对照组比较,PPI可诱导PC3与DU145细胞周期阻滞于S期(P<0.05)。3.细胞迁移及侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力结果:(1)与对照组比较,PPI可明显抑制PC3与DU145细胞的迁移能力和侵袭能力(P<0.05)。4.Western-blot检测PC3与DU145细胞蛋白表达及Real-Time-PCR检测细胞LncRNA HOTAIR的表达结果:(1)不同剂量PPI处理PC3与DU145细胞后,细胞内EZH2及DNMT1蛋白的表达都呈剂量依赖的下调趋势,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);PC3与DU145细胞予PPI处理后,HOTAIR的表达下调,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)瞬时转染法结果显示,沉默LncRNA HOTAIR可使EZH2及DNMT1蛋白表达下调;过表达HOTAIR可逆转PPI对EZH2及DNMT1的下调作用;过表达EZH2可逆转PPI对DNMT1蛋白的下调作用;过表达DNMT1可逆转PPI对EZH2蛋白的下调作用。5.启动子活性实验检测EZH2启动子活性结果:(1)与对照组比较,PPI可使PC3与DU145细胞的EZH2启动子活性下调(P<0.05)。(2)过表达HOTAIR可逆转PPI对PC3与DU145细胞EZH2启动子活性的下调作用。6.裸鼠皮下种植去势抵抗性前列腺癌DU145细胞实验结果:(1)与对照组比较,PPI组使DU145移植瘤裸鼠的肿瘤体积、肿瘤重量变小(P<0.05)。(2)DU145移植瘤组织中,与对照组比较,PPI组HOTAIR、EZH2、DNMT1的表达下调(P<0.05)。第二部分:1.MTT法检测细胞活力实验结果:(1)PPI联合恩杂鲁胺对去势抵抗性前列腺癌PC3与DU145细胞生长有抑制作用,与单独使用PPI或恩杂鲁胺相比较,联合给药表现出更好的抑制作用(P<0.05)。(2)过表达MUC1可逆转PPI对PC3与DU145细胞生长的抑制作用。2.流式细胞术检测细胞周期结果:(1)PPI联合恩杂鲁胺可诱导PC3与DU145细胞周期阻滞于S期,与单独使用PPI或恩杂鲁胺相比较,联合给药表现出更好的诱导作用(P<0.05)。3.Western-blot检测PC3与DU145细胞蛋白表达及Real-Time-PCR检测细胞HOTAIR的表达结果:(1)不同剂量PPI处理PC3与DU145细胞后,细胞内P50蛋白的表达无变化;P65及MUC1蛋白的表达都呈剂量依赖的下调趋势,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)瞬时转染法结果显示,沉默HOTAIR对P65、P50的表达无影响,可使MUC1蛋白表达下调;过表达P65可逆转PPI对HOTAIR和MUC1蛋白及MUC1 mRNA的下调作用;过表达MUC1不可逆转PPI对HOTAIR和P65蛋白的下调作用,对P50的表达无影响;过表达HOTAIR可逆转PPI对MUC1蛋白的下调作用,不可逆转对P65的下调作用,对P50的表达无影响。(3)PPI联合恩杂鲁胺能抑制PC3与DU145细胞P65、P50及MUC1蛋白及HOTAIR的表达,且比单独使用PPI或恩杂鲁胺变现出更好的抑制作用(P<0.05)。4.启动子活性实验检测MUC1启动子活性结果:(1)与对照组比较,PPI可使PC3与DU145细胞的MUC1启动子活性下调(P<0.05);PPI联合恩杂鲁胺对MUC1启动子活性的下调作用比单独使用PPI更强(P<0.05)。(2)过表达HOTAIR可逆转PPI对PC3与DU145细胞MUC1启动子活性的下调作用。5.裸鼠皮下种植去势抵抗性前列腺癌DU145细胞实验结果:(1)PPI联合恩杂鲁胺组与单独PPI组或恩杂鲁胺组比较,可使肿瘤体积及肿瘤重量变得更小(P<0.05)。(2)DU145移植瘤组织中,与对照组比较,PPI组P65、MUC1及HOTAIR的表达下调(P<0.05),PPI联合恩杂鲁胺组与单独PPI组或恩杂鲁胺组比较,对P65、MUC1及HOTAIR表达的下调作用更明显,各组对P50的表达皆无影响。结论:1.重楼皂苷I以剂量及时间依赖性抑制去势抵抗性前列腺癌PC3和DU145细胞的生长;可诱导细胞阻滞于S期和抑制PC3和DU145细胞的侵袭与迁移能力。2.重楼皂苷I能通过调控HOTAIR/DNMT1/EZH2及NF-Κb/HOTAIR/MUC1信号通路抑制细胞增殖。3.重楼皂苷I联合恩杂鲁胺抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的生长及诱导细胞阻滞于S期具有协同作用。4.重楼皂苷I以及联合恩杂鲁胺能抑制裸鼠体外前列腺癌移植瘤的生长,其作用机制分别与HOTAIR/DNMT1/EZH2及NF-Κb/HOTAIR/MUC1信号通路的调控密切相关。综合细胞及动物实验研究,发现PPI具有高效的抗前列腺癌作用,联合恩杂鲁胺能产生中度协同效应;并阐释了其发挥抗肿瘤作用的分子机制与HOTAIR/DNMT1/EZH2及NF-Κb/HOTAIR/MUC1信号通路的调控相关;为去势抵抗性前列腺癌的治疗提供新的潜在分子靶点及实验依据。