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【目的】①重组大鼠溶菌酶C端基因片段在大肠杆菌中高效表达。②分析大鼠溶菌酶C端多肽与晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)的结合活性。③探讨大鼠溶菌酶N端多肽对AGEs的清除作用及机制。【方法】①采集SD大鼠外周血液,分离白细胞,用Trizol法提取总RNA;用RT-PCR扩增大鼠溶菌酶C端基因片段。②将大鼠溶菌酶的c端基因片段插入载体pET-30a(+)构建重组表达载体pLy70,双酶切鉴定和序列分析。③将重组载体pLy70转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,诱导表达目的多肽并对诱导表达条件进行优化。④SDS-PAGE和Western blotting鉴定Ni~+-NTA agarose亲和柱纯化和制备的目的多肽。⑥晚期糖基化牛血清白蛋白的体外制备。⑦双抗夹心ELISA法测定LY70对AGEs的结合活性。⑧细胞实验分析LY77(重组大鼠溶菌酶C端多肽)对AGEs的清除作用以及RT-PCR测定AGEs受体RAGE mRNA表达水平的变化。【结果】1)重组表达质粒构建:①由大鼠白细胞提取的总RNA经EB琼脂糖电泳后出现28S、18S、5S三条带,含量比约为5:3:1,经RT-PCR扩增出210bp条带,大小与预计相符。②构建重组表达质粒pET-30a(+)/LY70,经双酶切鉴定和序列分析,结果与理论预期的完全符合。2)重组大鼠溶菌酶C端基因片段在大肠杆菌中高效表达:①诱导重组质粒转化菌表达出重组多肽LY70,经SDS-PAGE和Western blotting检测分析,LY70主要以可溶性形式存在。②诱导条件优化:在37℃,诱导5小时和IPTG浓度0.2 mmol/L时,LY70在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达水平可达到最大值,重组多肽LY70含量约为90mg/L,占可溶性蛋白60%以上。3)经Ni~+-NTA agarose亲和柱纯化和G-25脱盐,制备出重组多肽LY70通过Maillard反应体外制备晚期糖基化牛血清白蛋白BSA-AGEs。4)双抗夹心ELISA法分析显示,目的多肽LY70与AGEs基本上没有结合作用。5)细胞实验显示,LY77对AGEs有明显的清除作用;同时,LY77能有效地抑制AGEs上调其受体RAGE mRNA表达的作用。【结论】1)成功构建了大鼠溶菌酶重组表达质粒pET-30a(+)/LY70。2)重组大鼠溶菌酶C端基因片段在大肠杆菌Rosetta(DE3)中实现高效表达,重组多肽LY70主要以溶解形式存在。3)重组多肽LY70对AGEs基本上没有结合活性,证明溶菌酶对AGEs的结合位点在其N端附近。4)大鼠溶菌酶N端多肽LY77通过结合AGEs而达到清除后者的作用,同时导致AGEs受体RAGE基因表达减弱。