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1目的:类风湿关节炎（RA）是一种难治性自身免疫性疾病,以慢性滑膜炎症增生、血管翳形成并侵蚀软骨、最终导致骨与关节破坏为病理特征[1]。风湿祛痛胶囊（FSQTC）是临床治疗RA的中药复方制剂,能有效抑制大鼠佐剂性关节炎[2],但对胶原诱导性关节炎和RA滑膜血管新生的作用如何则尚不清楚。本项目采用Ⅱ型胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型和多种体内、体外血管生成的模型,研究风湿祛痛胶囊对RA滑膜血管新生作用,并从蛋白激酶B（AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路初步探索其作用机制。2方法:（1）SD大鼠按体质量随机分为正常组（Control组）,模型组（Model组）,风湿祛痛胶囊低剂量组（0.25 g/kg）,风湿祛痛胶囊中剂量组（0.5 g/kg）,风湿祛痛胶囊高剂量组（1 g/kg）,阳性对照甲氨蝶呤组（MTX 0.2 mg/kg）,每组10只。建立CIA大鼠模型,通过关节红肿和畸形症状、关节炎临床积分、发病率、组织病理学（HE）、影像学（Micro-CT）等检查,评价风湿祛痛胶囊对CIA治疗作用及特点;（2）通过组织病理学（HE）检查CIA大鼠炎症关节滑膜中血管形态和分析血管密度,结合免疫组化检测滑膜中血管内皮细胞标志物血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）的表达、免疫荧光双染观察滑膜中CD31和α平滑肌肌动蛋白（αSMA）的表达,观察风湿祛痛胶囊对CIA大鼠滑膜血管新生的影响,并结合血管内皮生长因子（VEGF）诱导的大鼠主动脉环血管生成实验评价其体外对血管生成的直接作用;（3）采用VEGF诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移、粘附、侵袭和管腔形成实验体外模拟血管形成的过程观察风湿祛痛胶囊对血管内皮细胞功能的影响,以探索其影响血管生成过程的作用环节;（4）由于RA滑膜细胞炎症增生与血管新生密切相关,故采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导人类风湿性关节炎成纤维细胞（MH7A）增殖、迁移、粘附、侵袭实验观察风湿祛痛胶囊对成纤维滑膜细胞功能的影响,以探索其对血管生成过程的间接影响;（5）采用酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫组化、蛋白质印迹法（WB）和/或实时聚合酶链反应（real time PCR）等方法检测CIA大鼠血清、滑膜组织促血管新生调控因子白介素-1β（IL-1β）、TNF-α、VEGF、转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）及下游AKT和MAPK信号通路的影响。3结果3.1风湿祛痛胶囊对CIA大鼠的治疗作用风湿祛痛胶囊（0.25、0.5、1 g/kg）可以呈剂量依赖性地改善CIA大鼠炎症关节红、肿和畸形症状,降低发病率和临床积分,抑制关节软骨侵蚀、骨破坏、滑膜炎症和血管翳生成等组织病理学改变程度,且高剂量组的作用与对照药甲氨蝶呤作用相近。3.2风湿祛痛胶囊对CIA大鼠滑膜血管新生的作用风湿祛痛胶囊（0.25、0.5、1 g/kg）具有抑制CIA大鼠滑膜血管新生的作用:降低CIA大鼠关节滑膜的血管密度,抑制CD31的阳性表达量、CD31+/αSMA-不成熟血管和总血管的阳性表达IOD值,对CD31+/αSMA+成熟血管则无明显影响,且中、高剂量的作用显著,甲氨喋呤的作用与高剂量相近。3.3风湿祛痛胶囊对大鼠主动脉环血管新生的影响风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5ng/mL）能显著降低VEGF（20 ng/mL）诱导升高的大鼠主动脉环芽出的血管数量、长度和面积。3.4风湿祛痛胶囊对HUVEC增殖、迁移、侵袭、粘附能力、管腔形成能力的影响风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5 ng/mL）作用48h能剂量依赖地抑制HUVEC增殖活性,作用24h内对VEGF（20 ng/mL）诱导的HUVEC迁移、粘附、侵袭和管腔形成能力有明显抑制作用。3.5风湿祛痛胶囊对MH7A增殖、迁移、侵袭、粘附能力的影响风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5 ng/mL）体外给药,作用24h对TNF-α（20 ng/mL）诱导的MH7A细胞增殖活性没有明显影响,作用48h能降低TNF-α（20 ng/mL）诱导增加的MH7A细胞增殖活性,且有浓度依赖现象,作用24h内还能显著降低TNF-α（20 ng/mL）诱导升高的MH7A细胞迁移、粘附、侵袭能力。3.6风湿祛痛胶囊对CIA大鼠和体外促血管新生调控因子蛋白表达水平的影响风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5 ng/mL）能明显降低CIA大鼠炎症关节和血清中VEGF的含量、降低CIA大鼠血清中IL-1β、TNFα、VEGF、TGF-β、PDGF的含量,且高剂量组的作用与对照药甲氨蝶呤作用相近;并且体外显著降低TNF-α诱导的MH7A上清中IL-1β和VEGF的含量。3.7风湿祛痛胶囊对CIA大鼠和体外调控血管生成的VEGFR2磷酸化、蛋白和基因表达水平的影响风湿祛痛胶囊（0.25、0.5、1 g/kg）能明显抑制CIA大鼠血清中VEGFR2的含量,且高剂量组的作用与对照药甲氨蝶呤作用相近;风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5 ng/mL）能显著降低因VEGF（20 ng/mL）诱导异常升高的HUVEC细胞中p-VEGFR2水平和VEGFR2的蛋白水平,表明风湿祛痛胶囊能抑制VEGF诱导的HUVEC细胞VEGFR2磷酸化和蛋白表达量。风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5 ng/mL）能剂量依赖地降低由（20ng/mL）诱导异常升高的HUVEC中VEGFR2 mRNA表达水平,提示风湿祛痛胶囊能通过负调节VEGF诱导增高的VEGFR2基因转录从而抑制相关蛋白。3.8风湿祛痛胶囊对CIA大鼠和体外的AKT和MARK信号通路的影响风湿祛痛胶囊（0.25、0.5、1 g/kg）显著降低CIA大鼠炎症关节内磷酸化蛋白激B（p-AKT）、p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化（p-p38 MAPK）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）及c-Jun氨基末端激酶磷酸化（p-JNK）蛋白表达水平,风湿祛痛胶囊（0.02、0.1、0.5 ng/mL）体外能显著降低VEGF（20 ng/mL）诱导的HUVEC和TNF-α（20 ng/mL）诱导的MH7A细胞磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、p-p38、p-ERK及p-JNK蛋白表达水平。4结论:本研究通过CIA大鼠模型和多种体内、体外血管生成模型,证明风湿祛痛胶囊能有效治疗实验性RA,对RA滑膜血管新生（血管翳形成）有明显的抑制作用。相关机制可能和其下调VEGFR2等促血管新生调控因子及p-AKT、p-JNK、p-p38和p-ERK1/2下游信号通路的异常活化,进而抑制血管内皮细胞和RA成纤维样滑膜细胞的迁移、黏附、侵袭和/或管腔形成等功能有关。鉴于风湿祛痛胶囊是由多味虫蛇类药组成的中成药,本研究结果将有助于“通络开痹”功效的阐明及虫蛇类方剂药效作用特点的发现,指导其临床合理用药。