内源性激素主要包括四大类：皮质激素、雌激素、雄激素和孕激素。这些激素在体内通过不同的酶相互转化,作用到人体各个神经和组织,然后通过调节各种组织细胞的代谢活动来影响人体的生理活动,其浓度的异常变化也与某些疾病的发病机制密切相关,所以,近几年来,内源性激素的测定一直是体内药物分析研究的热点,建立高灵敏度和高专属性的分析方法,准确测定内源性激素含量,探索人类机体调控机能和疾病的发病机制,为疾病的诊断和治疗提供依据。在本课题中,我们选择了临床应用较多且具有代表性的11种内源性激素或其代谢产物作为研究对象,其中包括皮质激素(可的松、氢化可的松、四氢化可的松、氢化四氢化可的松、allo-氢化四氢化可的松)、雌激素(雌二醇)、雄激素(睾酮、二氢睾酮、脱氢表雄酮)和孕激素(孕酮、17α-羟基孕酮),建立不同的分析方法测定人血浆和尿液中内源性激素的含量。这11种激素与体内的某些代谢酶活性及人体生长发育、临床常见疾病关系尤为密切。例如,孕酮在胚胎发育等发面具有重要作用;雌二醇与弱视失明、骨质疏松等疾病有关；可的松和氢化可的松通过11β-羟类固醇脱氢酶(11β-HSD)相互转化,而11β-HSD与糖尿病、认知功能及胚胎发育有关,因此测定两种激素及其代谢产物的浓度比值可考察此种酶的活性水平,进而为临床某些疾病的治疗和诊断提供参考。本文共分三章。在第一章中,我们选择较为简单的高效液相色谱法测定9种内源性激素,并将该方法用于实际生物样品中内源性激素的测定。在前处理方面,采用固相萃取法,由于四氢化可的松和氢化四氢化可的松在尿样中以缀合物的形式存在,所以尿样需经葡萄糖醛酸酶水解后再固相萃取。在波长选择方面,因为四氢化可的松、氢化四氢化可的松、allo-氢化四氢化可的松结构中没有共轭体系,17β-雌二醇浓度水平低(205nm吸收强),这四种组分选用205nm作为检测波长；可的松、氢化可的松、睾酮、孕酮、17a-羟基孕酮含有不饱和酮基,在245nm波长处灵敏度最高,故实验选用205nm和245nm两个波长同时检测9种内源性激素。血样及尿样经系统方法学考察,虽然方法具有较强的专属性和较高的灵敏度,但是在实际生物样品分析中发现,内源性物质仍然存在较大干扰,方法可满足外源性激素的测定要求,但无法满足内源性激素的测定要求。所以,在第二章中,我们建立了灵敏度相对更高、专属性更强的液相色谱质谱联用法对内源性激素进行分析测定,色谱质谱联用方法的灵敏度和分析速度都有明显提高,但影响因素也较多,睾酮和孕酮等无法被准确测定。在第三章中,我们以地塞米松为内标,建立了液相色谱-串联质谱测定9种内源性激素的方法(可的松、氢化可的松、四氢化可的松、allo-/氢化四氢化可的松、雌二醇、睾酮、孕酮、17a-羟基孕酮)。生物样品前处理分别比较了蛋白沉淀法、液液提取法和固相萃取法三种方法,考察基质效应和回收率,发现固相萃取基质效应较小、回收率较高,所以生物样品前处理采用固相萃取法进行。在色谱质谱优化方面,我们考察了正离子和负离子两种模式下,被测组分离子化情况,发现正离子模式下,背景和杂质信号干扰较少,被测组分离子化效率更稳定,而且在流动相中加入0.1%甲酸可以明显增强离子响应。实验考察了方法的专属性、灵敏度、基质效应、线性、精密度、准确度和稳定性,结果显示该方法专属性强、灵敏度高。将该方法应用于胎儿发育迟缓的孕妇尿样和胎儿脐血及胎儿正常发育的孕妇尿样和胎儿脐血中内源性激素测定,结果显示胎儿发育迟缓的孕妇体内氢化可的松／可的松的浓度比值、氢化四氢化可的松／四氢化可的松的浓度比值均高于对照组,且孕妇体内雌激素和孕激素浓度较正常女性体内的浓度偏高,雄性激素浓度较正常女性体内的浓度偏低,内源性激素水平变化与胎儿发育具有密切关系。此外,我们也应用LC-MS/MS方法测定癫痫病人血样中的雄激素,研究内源性雄激素与癫痫病的关系。结果表明,癫痫患者血样内睾酮、二氢睾酮和脱氢表雄酮浓度水平偏低,而γ-氨基丁酸和谷氨酸含量较正常人明显偏高,说明雄激素的降低可能使得致癫兴奋性氨基酸含量升高。