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研究背景和目的:神经肌肉接头（Neuromuscular junction,NMJ）是一种化学突触,被施万细胞（Schwann cells,SCs）所包裹。该突触形成于运动神经元和骨骼肌之间。当动作电位到达时,运动神经元轴突末梢释放乙酰胆碱（Acetylcholine,ACh）,ACh结合肌纤维上的乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptors,AChRs）,引起受体开放,产生终板电位（End-plate potential,EPP）。EPP使肌细胞产生动作电位,触发肌浆网（Sarcoplasmic reticulum,SR）释放Ca2+。肌丝蛋白-肌钙蛋白结合Ca2+,引起粗细肌丝相对滑行,肌肉收缩。NMJ对于我们的身体活动和日常生活必不可少,其形成和维持缺陷会导致多种疾病发生,例如先天性肌无力综合征（Congenital myasthenia syndrome,CMS）,重症肌无力（Myasthenia gravis,MG）等,严重影响身体健康。NMJ的发生发育受到agrin/Lrp4（Low density lipoprotein receptor-associated protein 4）/Mu SK（Muscle-specific tyrosine kinase）/Dok-7（Docking protein 7）经典信号通路的调控,该信号通路中的每一成员都是形成成熟NMJ所必须的。但目前Dok-7下游的信号分子尚不清楚。我们借助磷酸化蛋白组学的方法进行了Dok-7下游分子的筛选。我们共筛选到18个依赖于agrin信号通路的丝氨酸/苏氨酸磷酸化蛋白,其中包含了II型亲联蛋白（Junctophilin-2,JPH2）。在成肌细胞中加入agrin蛋白刺激后,JPH2的磷酸化水平上调;然而,在Dok7基因敲除的成肌细胞中加入agrin刺激后,未观察到JPH2磷酸化水平的升高,提示JPH2位于agrin/Dok-7的下游。在本研究中,我们在细胞和分子水平上探究了JPH2表达改变对AChRs的聚集和维持的影响,以阐明Dok-7下游分子JPH2在agrin经典信号通路中的作用。方法:运用实时荧光定量PCR技术和免疫印迹技术检测JPH2在成肌细胞内的表达情况;运用CRISPR-Cas9技术和基因敲低技术降低成肌细胞中JPH2的表达,观察AChRs的聚集情况;通过基因定点突变技术构建模拟不同磷酸化状态的JPH2突变体,过表达这些突变体拯救AChRs的聚集,验证不同的磷酸化状态对AChRs聚集的影响;通过电转技术敲低肌纤维中JPH2的表达,观察NMJ的形态结构改变。结果:1.随着分化天数的延长,成肌细胞中JPH2与α-ACh R（由Chrna1基因所编码）的m RNA表达水平先升高后降低,表现出相似的变化趋势。免疫印迹实验表明JPH2在成肌细胞中稳定表达。2.筛选出了有效的sg-Jph2和sh-Jph2,用于降低JPH2的表达。3.在成肌细胞中转染sg-Jph2和sh-Jph2,降低JPH2的表达水平,可以明显减少肌管中agrin诱导产生的ACh R簇。4.经基因定点突变技术构建的模拟不同磷酸化状态的JPH2突变体蛋白表达水平相似。5.在成肌细胞中共转模拟不同磷酸化状态的JPH2突变体和基因敲低克隆进行拯救实验。统计分析结果表明模拟磷酸化状态的JPH2突变体（S593E和S597D）拯救了ACh R簇的形成,而模拟非磷酸化状态的JPH2突变体（S593A和S597A）则不能拯救。6.对成年C57小鼠（AChRs已发育成熟）进行了胫骨前肌（Tibialis anterior muscle,TA muscle）的电转实验降低JPH2的表达。在电转12天之后观察AChRs形态结构的改变。我们发现基因敲低组小鼠骨骼肌中成熟状态的NMJ明显减少,且AChRs的面积也显著缩小。结论:JPH2蛋白位于agrin/Lrp4/Mu SK/Dok-7信号通路的下游,其磷酸化促进肌管ACh R簇的形成,对成年小鼠AChRs的稳定起到了支持作用。