金黄色葡萄球菌是常见的重要人类病原菌,易污染禽类、肉类和奶制品等蛋白含量丰富的食品,也易在食品及加工器具表面形成生物膜,引起食品腐败和疾病的传播,威胁人类健康。预防金黄色葡萄球菌感染也成为人们研究的热点,目前大多采用化学杀菌剂。但由于细菌耐药性变强,人们急需寻找一种新的天然抑菌防腐剂来代替化学杀菌剂。本文通过研究冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性、蛋白质合成和呼吸代谢,以及对金黄色葡萄球菌生物膜形成的细胞间多糖黏附素的合成、胞外DNA的释放和生物膜形成相关ica A、cid A、agr A和sar A基因表达量的影响,探讨冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌及其生物膜形成的抑制机制,为其在为其在食品行业和畜牧业中治理金黄色葡萄球菌生物膜问题提供一定理论基础。主要研究结果如下:(1)采用二倍稀释法研究了冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并考察了温度、p H和紫外处理对冬凌草甲素的抑菌活性的影响。试验结果显示,冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为25μg/m L和50μg/m L;加热处理冬凌草甲素对其抑菌活性具有提高的作用,90℃处理30 min,冬凌草甲素的抑菌活性仍高于对照组;中性和酸性环境对冬凌草甲素的抑菌活性有一定的提高作用,但碱性环境冬凌草甲素的抑菌活性降低;短时间的紫外线处理并不影响冬凌草甲素的抑菌活性,但紫外线处理时间大于15 min,其抑菌活性呈现下降趋势。(2)采用分光光度计和SDS-PAGE技术研究了冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性、呼吸代谢途径和蛋白质合成能力的影响。试验结果显示,冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌后,培养液的电导率升高,β-D-半乳糖苷酶活性增高,核酸外泄量也增加,2MIC药物组处理6h后的电导率比空白组升高了17%(P<0.01),处理12h后的β-D-半乳糖苷酶活性比空白组提高了54%(P<0.01),胞外核酸大分子含量显著高于对照组(P<0.01);冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌9h,菌体可溶性蛋白质总量比对照组减少了50%(P<0.01);冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌三羧酸循环中的关键酶活性,其中对苹果酸脱氢酶活性抑制率为53.22%(P<0.01),对琥珀酸脱氢酶的活性抑制率为33.96%(P<0.01)。试验结果表明冬凌草甲素通过破坏细菌细胞膜的通透性,抑制菌体内的蛋白质合成和代谢关键酶的活性发挥杀菌作用。(3)采用结晶紫染色法研究了亚抑制浓度的冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。试验结果显示,与对照组相比,在1/2MIC和1/4MIC冬凌草甲素作用下,金黄色葡萄球菌生物膜形成量分别下降了61%和50%,差异极显著(P<0.01);在1/8MIC冬凌草甲素作用下,金黄色葡萄球菌生物膜形成量也下降了19%,差异显著(P<0.05)。扫描电镜观察结果也显示,未添加冬凌草甲素的对照组菌体聚集成团,连成一片;而药物处理组金黄色葡萄球菌生物膜的形成量则随着冬凌草甲素浓度的增大而降低,冬凌草甲素含量为1/2MIC时,细菌多呈分散状态,部分聚集一起,但没有出现堆叠成团的现象。试验结果表明,冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。(4)采用刚果红平板法和分光光度法研究了冬凌草甲素抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的机制。试验结果显示,冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌生物膜中PIA的合成和e DNA释放量,与对照组相比,1/4MIC冬凌草甲素作用16 h后,金黄色葡萄球菌e DNA的释放量降低了48.62%,差异极显著(P<0.01)。(5)采用RT-PCR技术研究了冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌生物膜形成相关基因表达的影响。试验结果显示,冬凌草甲素能抑制与金黄色葡萄球菌生物膜形成相关的ica A、cid A、agr A和sar A基因表达。与对照组相比,1/2MIC的冬凌草甲素作用金黄色葡萄球菌16 h后,ica A基因的表达量降低了91.6%;cid A基因的表达量降低了94.7%;agr A基因的表达量降低了77.6%,sar A基因的表达量降低了70.4%。这表明冬凌草甲素是通过抑制生物被膜相关基因ica A、cid A、agr A和sar A的表达而控制PIA的合成和e DNA释放来抑制生物被膜的形成。