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硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)属于古菌域中的泉古菌界,其最适生长温度约为80℃,最适生长pH约为3。硫磺矿硫化叶菌是研究古菌遗传机制的模式生物。
在DNA复制过程中,DNA引发酶合成RNA引物,从而启动DNA聚合酶催化的DNA新链合成。古菌引发酶由催化亚基(Pri1)和非催化亚基(Pri2)组成。在已测序的硫磺矿硫化叶菌基因组中,仅引发酶催化亚基的编码基因被注释。在本研究中,通过序列比对,获得了推测的引发酶非催化亚基的编码基因。在此基础上,构建了两个亚基的共表达载体,并在大肠杆菌中表达了两个基因,重组Pri1和Pri2在纯化过程中共洗脱。通过凝胶过滤和SDS-PAGE分析,确认二个重组蛋白形成了异源二聚体(Pri1/Pri2)。
引发酶二聚体Pri1/Pri2具有引物合成活性,而单独的Pri1则没有引物合成活性。滤膜过滤和凝胶过滤实验表明,Pri1/Pri2通过Pri2与模板DNA结合。Pri1/Pri2的引物合成活性依赖于二价阳离子。在所测试的二价阳离子(Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Co2+、Mn2+和Ni2+)中,仅Mn2+能够支持Pri1/Pri2的引物合成活性。Pri1/Pri2催化的引物合成反应的最适温度为~55℃时。该复合物具有一定的热稳定性:70℃处理1 hr后,引物合成活性无显著变化,但80℃处理15 min后,活性降低约50%。Pri1/Pri2能够利用ATP或dATP为底物进行引物合成,但优先利用dATP。引发酶二聚体还具有引物延伸、末端转移以及二核苷酸合成等多种活性。
酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验显示,硫磺矿硫化叶菌DNA引发酶与复制因子C(RFC)之间存在相互作用。根据文献,RFC能够将滑夹(PCNA)装载到DNA模板上,后者通过将DNA聚合酶拴在模板上、使之能够连续合成DNA链。硫磺矿硫化叶菌的RFC为含一个大亚基(RFC1)和四个相同小亚基(RFCs)的异五聚体(RFCs/RFC1)。在本研究中发现,RFCs与Pri1和Pri2之间均存在相互作用。胰蛋白酶敏感性实验表明,Pri/Pri2能够降低RFCs/RFCl对胰蛋白酶的敏感性,进一步证明了引发酶与RFC之间的相互作用。引发酶与RFC之间也存在功能上的相互作用。一方面,RFC能够抑制Pri/Pri2的引物合成、引物延伸以及末端转移活性。这种抑制作用不依赖于RFC的ATP结合和水解活性。RFC与Pri/Pri2之间的相互作用能够降低后者对DNA模板的结合力。这可能是RFC抑制Pri/Pri2的引物合成、引物延伸以及末端转移活性的原因。此外,RFC能够激活Pri/Pri2和Pri1的二核苷酸合成活性,这种激活作用不依赖于模板的存在。另一方面,引发酶二聚体能够激活RFC的ATPase活性,而单独的Pri1或Pri2均无此作用。基于上述结果,本论文提出,古菌引发酶与RFC之间的互作在引物合成及转移过程中起重要的调控作用。