炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)和克罗氏病(Crohn’s disease,CD),是一种常见的肠粘膜炎症性疾病,其病因及发病机制目前尚不十分明确,主要涉及环境、遗传、微生物感染、免疫功能紊乱及精神等多方面因素。其中免疫因素在 IBD 发病中的作用日益受到重视,成为研究的热点。西医主要用 5-氨基水杨酸类制剂、糖皮质激素及免疫抑制和免疫调节剂等治疗本病。 中医多将本病归于“泄泻”、“痢疾”等范畴,多根据不同症状表现分为多种证型进行对证治疗。四神方、香连方、肠泰方(四神方和香连方合方基础上,适当加减而成)分别具有温肾涩肠、清热化湿和温肾清化的功效,作为临床 IBD 中医药治疗的常用方药,其疗效机理目前尚不清楚。为探讨体现中医三法的三方对实验性结肠炎的效用机理的异同,本研究利用小鼠 IBD 模型观察比较了三方对实验性结肠炎的防治作用,并对其可能的免疫学作用机制或作用环节进行了探讨。 一、IBD 模型小鼠的复制 1、TNBS 小鼠模型:雌性 Balb/c 小鼠,分别用 1%、1.5%、2%的 TNBS 50%乙醇溶液 100μl 灌肠造模,通过对小鼠一般情况、死亡率、DAI 评分、结肠肉眼观及病理切片组织学评分、结肠组织 MPO 含量等指标的观察、测定,确定 1.5%的 TNBS 50%乙醇溶液 100μl 为较合适的造模剂量;对此剂量复制的模型进行不同时间点的以上指标的观察,发现造模后 10 天,模型小鼠仍维持肠粘膜的亚急性到慢性炎症病变,为较合适的造模时间。 2、DSS 小鼠模型:选用 C57BL/6 小鼠,3% DSS 溶液饮用 5 天,停用 3 天,可成功复制 DSS 小鼠实验性结肠炎模型。 结合人类 CD 和 UC 的病理特征及临床症状,通过对两种模型病理变化及症状的对比观察,认为 TNBS 模型小鼠病变类似于人类 CD,DSS 模型小鼠病变类似于人类UC。 二、肠泰、四神、香连方对实验性结肠炎的防治作用 分别选用 TNBS 小鼠模型和 DSS 小鼠模型,就肠泰方、四神方和香连方及 SASP对两种模型的干预作用进行研究。结果显示,肠泰方、四神方和香连方在造模后给药8 天(TNBS 模型)或造模同时给药 8 天(DSS 模型)均能明显减轻模型小鼠腹泻、便血等症状,抑制其体重的减轻,并明显改善其结肠肉眼观及组织学损伤,降低其结肠组织升高的 MPO 含量,表明三方均能有效地防治 IBD,肠泰大、中剂量疗效显著优于 SASP,四神方效果与肠泰相当,香连方在降低模型小鼠死亡率及抑制体重减轻方面效果不及四神和肠泰。2 肠泰、四神及香连方防治小鼠实验性结肠炎效用机理的研究三、肠泰、四神、香连方防治 TNBS 小鼠肠粘膜炎症的免疫学机制探讨选用 Balb/c 小鼠复制 TNBS 小鼠结肠炎模型,造模后第 2 日起分别给予肠泰、四神、香连方灌胃,连续给药 8 天后处死动物,测定脾脏、MLN 中细胞表面协同刺激分子的表达,LPL 中 T 淋巴细胞亚群的比例,细胞因子的含量等指标,探讨药物的免疫学作用机制。1、对 T 细胞活化的影响通过 ELISA 法测定结肠培养上清中 IL-12/23 的水平,表面荧光染色法测定细胞表面协同刺激分子的表达,MTT 法测定 T 细胞的增殖水平,观察模型小鼠 T 细胞的活化情况及三个方剂的干预作用。结果显示,TNBS 模型小鼠可能通过 CD40-CD40L和 B7(CD80/CD86)- CD28/CTLA4 途径促进粘膜局部 T 细胞大量活化而引发炎症,且其黏膜局部也存在促使 T 细胞活化并分化为 Th1 的细胞因子环境。肠泰、四神、香连三方均能通过降低模型小鼠T淋巴细胞表面协同刺激分子的表达而抑制粘膜局部T细胞的活化,并抑制 APCs 分泌 IL-12/23 而抑制活化的 T 细胞向 Th1 方向极化。同时三方均能显著增强模型小鼠脾脏 T 细胞的增殖,以肠泰和四神方的作用更明显。2、对 CD4+ T 细胞极化的影响采用胞内细胞因子荧光染色法测定小鼠 LPMC 中 Th1、Th2 亚群的比例;ELISA法测定脾脏、MLN、LPMC 中 IFN-γ、IL-4、TNF-α的含量,并观察药物作用。研究结果显示,TNBS 模型小鼠 LPMC 中 CD4+ T 细胞主要向 Th1 方向极化,LPMC、MLN、结肠器官培养上清中 IFN-γ的含量及结肠培养上清中 TNF-α的含量均显著升高。肠泰、四神、香连三方均能显著抑制模型小鼠 CD4+ T 细胞向 Th1 方向极化,显著抑制结肠培养上清中 TNF-α的产生,显著增加模型小鼠 LPMC 和 MLN 中细胞分泌的 IL-4 含量。3、对免疫调节因素的影响采用胞内荧光染色法测定模型小鼠 LPMC 中分泌 IL-10 的 T 细胞数,表面荧光染色法测定脾脏、MLN 中 CD4+CD25+细胞的比例,表面荧光染色法测定 CD4/CD8 T 细胞比例,并观察药物作用。结果显示,TNBS 模型小鼠 MLN 和 LPMC 中表达 IL-10的 CD4+T 细胞数及 CD3+CD8+ T 细胞比例显著降低;肠泰、四神、香连三方均能显著提高模型小鼠 CD4+CD25+T 细胞的百分率,显著升高 IL-10 的表达,香连方作用相对较弱。肠泰和四神方均能显著升高 MLN 中 CD3+CD8+T 细胞的比例,香连方对此则无明显影响。4、对结肠炎症效应的影响采用免疫组化法测定模型小鼠结肠组织 NF-kB 的表达,生化法测定结肠组织