七清败毒颗粒抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是一种严重危害养殖业发展的猪传染病,主要临床特征为母猪繁殖障碍性疾病和仔猪呼吸系统疾病,1996年我国首次从感染猪体内分离出PRRSV,自此该病在全国范围内广泛流行,给国内养猪业造成了巨大的经济损失。目前针对PRRSV的防制措施主要以疫苗免疫为主,但也存在一定的局限性,如免疫失败、弱毒苗毒力返强等不确定因素。因此,积极寻求PRRS新的防控方案是近年来动物疫病防控领域研究的热点。中药蕴含结构丰富、活性多样的天然化合物,是寻找有效抗病毒药物的资源库。相关资料报道具有抗病毒效果的中药已多达189种,其中以板蓝根、黄芪和金银花等中药单体研究较多,有关抗PRRSV的复方中药筛选及其药效研究较少,针对各药物的抗病毒机制、最佳用药剂量等方面尚不十分清晰。因此本研究拟以复方中药七清败毒颗粒为切入点展开深入研究,从体外、体内抗PRRSV试验对七清败毒颗粒抗PRRSV活性进行系统的评价,初步探究其作用机制。主要研究结果如下:(1)七清败毒颗粒体外抗PRRSV的作用。利用CCK-8法和荧光显微镜观察筛选药物作用时间与浓度,结合RT-qPCR和TCID50检测药物对PRRSV增殖的影响,结果发现相比病毒对照组,药物预防模式使PRRSV mRNA表达量降低了68%,治疗模式降低了53%,直接杀病毒模式降低了89%;病毒TCID50分别为10-3.25/100μL、10-4.36/100μL和10-2.36/100μL,显著低于病毒对照组(10-5.15/100μL)。表明七清败毒颗粒可抑制PRRSV-GFP在Marc-145细胞内的增殖。(2)七清败毒颗粒体内抗PRRSV的作用。设提前药物处理感染组(A组)、感染同时药物处理组(B组)、无药物处理感染组(C组)和空白对照组(D组)。A、B组分别于攻毒前3 d和攻毒时在基础日粮中添加七清败毒颗粒(10 g/d/头份),连续饲喂至攻毒后28 d,每日测量体温,观察病理变化,利用RT-q PCR和ELISA技术检测攻毒后第1、3、5、7、14、21、28、35 d PRRSV病毒血症和抗体水平变化。结果显示,A、B组仔猪体温在攻毒后第6 d上升至40℃以上,第12 d时恢复正常,C组仔猪体温在第5 d上升至40℃以上,持续至试验结束仍未恢复;A、B组仔猪肺脏病变较轻,肺泡结构轻度损伤,支气管内有少量炎性渗出物,周围有少量炎性细胞浸润,C组仔猪肺脏病变严重,肺泡结构破坏严重,支气管内有大量炎性渗出物和炎性细胞浸润;A组在攻毒后3、5、7、14 d病毒血症量极显著低于C组(P<0.01),B组在攻毒后3、5 d病毒血症极显著低于C组(P<0.01),第7、14 d病毒血症显著低于C组(P<0.05);A、B组PRRSV抗体在攻毒后第21 d达到峰值,C组在28 d达到峰值。表明七清败毒颗粒能显著减轻PRRSV造成的仔猪肺部病理损伤,降低病毒血症,使PRRSV特异性抗体峰值提前,减少病毒血症持续时间。(3)七清败毒颗粒对仔猪外周血单核细胞免疫因子表达的影响。断奶仔猪基础日粮中添加七清败毒颗粒(10 g/d/头份),连续饲喂7 d,利用RT-qPCR技术检测饲喂后第0、1、3、5、7 d外周血单核细胞内IFN-α、IFN-γ、TNF-αmRNA表达变化。结果显示饲喂药物前后IFN-α、IFN-γ、TNF-αmRNA的表达无显著差异,表明七清败毒颗粒的间接抗病毒作用不明显,主要通过直接抗病毒途径发挥抗PRRSV作用。综上试验证明了七清败毒颗粒具有体外和体内抗PRRSV作用。其对PRRSV的预防作用和直接杀病毒作用效果显著。动物试验表明七清败毒颗粒能够有效缓解PRRS临床症状,减轻了PRRSV对仔猪脏器的侵袭,为PRRSV临床防控用药提供了理论基础。
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