研究背景胆囊癌在胆道系统恶性肿瘤中位居首位,在整个消化系统的恶性肿瘤中排名第5位。胆囊癌恶性程度极高,早期无特异表现,所以很多病人在就诊时已为晚期。仅有20%-30%的胆囊癌患者可以得到根治性手术切除,而胆囊癌对于化疗和放疗均不敏感,所以从基因角度探索胆囊癌的治疗具有重要意义。分化相关基因NDRG1是荷兰学者vanBelzen等1997年从结肠癌HT29-D4细胞株体外诱导分化过程中克隆到的一个新基因,该基因存在于人体多种组织,如肾脏、心、脑、骨骼肌、胎盘、肺组织、前列腺、小肠、大肠和卵巢等均有较高表达,而在外周血白细胞、免疫器官、肝脏等组织呈低表达,其表达的广泛性提示,该基因在多种组织细胞的分化及生长过程中可能起着重要作用。Kurdistani等研究发现,该基因在多种肿瘤细胞株和肿瘤组织,如乳腺癌、前列腺癌和结直肠腺癌等肿瘤组织中均呈低表达。但也有研究认为,肿瘤组织NDRG1基因表达显著升高。Cnaugl的研究认为,肺癌、脑瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和肾癌等癌组织NDRG1蛋白表达较正常对照组织显著升高,其表达升高是由于这些癌组织缺氧引起的,NDRG1可作为一种重要的衡量组织缺氧的标志物。但是,迄今尚无关于NDRG1基因在胆囊癌中表达的文献报道,对于该基因在胆囊癌中作用机制的研究则更是完全空白。因此,本研究拟应用各种分子和细胞生物学实验手段首次阐明NDRG1基因在胆囊癌中的表达状况,并进一步探讨其临床病理和预后意义以及相关分子机制。本实验的基本思路是：为系统地探讨NRDG1在胆囊癌的表达情况,研究其与胆囊癌发生、发展的关系,了解各种细胞增殖相关蛋白对GBC-SD细胞NDRG1表达的影响及NDRG1基因表达在细胞增殖中的作用,本研究采用免疫组化法、Western Blot法等技术,检测了141例胆囊癌组织和癌旁正常粘膜中NDRG1的表达情况；采用免疫细胞化学染色、免疫印迹法(Western Blot)检测NDRG1在胆囊癌GBC-SD细胞中的表达情况；采用基因转染过表达策略,通过对下游基因和表型的改变(主要要包括细胞增殖、侵袭和凋亡三个方而)进行观察和分析NDRG1基因在胆囊癌细胞中表达情况及其与肿瘤生长、细胞增殖和细胞周期变化的关系。通过以上实验,试图阐明NDRG1在胆囊癌的表达规律；探讨NDRG1基因在肿瘤细胞诱导分化过程中的作用；研究GBC-SD细胞NDRG1基因表达与肿瘤生长、细胞增殖、细胞周期的变化等的关系；以进一步了解NDRG1基因在胆囊癌诱导分化中的作用机制,为胆囊癌诱导分化治疗提供新的理论依据。第一章NDRG1编码蛋白在胆囊癌的表达、临床病理和预后意义目的N-myc下游调节基因1(NDRG1),是N-myc下游调节基因家族成员之一,在多种应激反应和细胞生长调节情况下均可被诱导产生。最近已经有研究证实,NDRG1在多种不同类型的肿瘤中的作用机制与抑制肿瘤转移相关,并推测NDRG1可能是一个肿瘤抑制基因。到目前为止,尚未有报道关于NDRG1在胆囊癌的作用机制。因此,本研究的目的是调查NDRG1在GBC的表达情况及其对愈后预测的作用。方法选取了141例胆囊癌患者的肿瘤组织标本,运用免疫组化方法分析NDRG1在其中的表达情况,NDRG1表达和临床病理因素、生存率的关系。结果NDRG1在GBC表达的比例为63.8%；NDRG1在正常的胆囊壁上皮组织中没有表达,而在肿瘤侵袭前沿细胞则表达显著；在组织学分级高、病理分期和临床分期晚、淋巴转移阳性、静脉／淋巴受侵情况下,NDRG1表达明显；此外, Kaplan-Meier曲线提示,NDRG1过度表达和总体生存率、无病生存率方面有明显的负相关性(二者P值=0.02)。此外,多因素分析显示NDRG1表达(风险比：3.338；P=0.02),临床分期(风险比：3.128；P=0.03)均是影响无瘤生存率的独立危险因素。结论通过本次研究,我们首次得出这些数据,NDRG1在GBC表达和临床病理的恶性程度相关,是一个独立的预示着患者无瘤生存率低的信息。我们的发现提示,在GBC中,NDRG1表达可能是一种新型的预测患者生存率的信息,并可能作为一个潜在的治疗靶标。第二章NDRG1编码蛋白在胆囊癌细胞系GBC-SD中的表达目的探讨NDRG1编码蛋白在胆囊癌细胞系GBC-SD中的表达方法免疫细胞化学染色：应用特异性识别NDRG1编码蛋白的NDRG1多克隆抗体检测其在胆囊癌细胞系GBC-SD的表达。免疫印迹：应用NDRG1多克隆抗体验证NDRG1编码蛋白在该细胞系中的表达。结果免疫细胞化学染色显示NDRG1蛋白在胆囊癌细胞系GBC-SD中呈阳性表达,兔疫印迹检测证实了这一发现,但NDRG1在该细胞系中表达较弱。结论NDRG1蛋白在胆囊癌细胞系GBC-SD中呈阳性表达。第三章NDRG1基因在胆囊癌细胞中的作用机制目的采用基因转染过表达策略,通过对下游基因和表型的改变(主要包括细胞增殖、侵袭和凋亡三个方而)进行观察和分析NDRG1基因在胆囊癌细胞中表达情况及其与肿瘤生长、细胞增殖和细胞周期变化的关系。方法质粒扩增及鉴定：大肠杆菌DH5α转化法扩增包含NDRG1完整开放阅读框架(ORF)的质粒pEGFP-NDRG1-N3和空载质粒pEGFP-N3,核酸内切酶Bam HI和KPnl双酶切和基因测序进行鉴定。质粒转染：以脂质体LipofectamineTM2000将上述质粒瞬时转染至胆囊癌细胞系GBC-SD。MTT检测：检测转染和未转染细胞增殖状况。流式细胞术：检测转染和未转染细胞细胞周期和凋亡。Transwell实验：检测转染和未转染细胞的迁移和侵袭。过河实验：检测转染和未转染细胞的迁移。免疫印迹：应用多种特异性抗体检测相关蛋白在转染和未转染细胞中的表达。结果扩增后双酶切及测序鉴定表明扩增结果正确。转染pEGFP-NDRG1-N3后细胞呈现明显增殖加速和细胞周期演进、迁移和侵袭增强及表阿霉素所诱导细胞凋亡的显著减轻。这些表型出现的同时伴有c-fos、c-jun、cyclinD1、MMp-2、MMp-9、uPA和Bcl-2表达上调及p16、P27、Bid和剪切型caspase-3表达下调。而转染pEGFP-N3质粒后及未转染细胞则无类似效应。结论NDRG1基因可促进胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭并可抑制其凋亡。这些作用可通过调节其下游多种基因的表达而实现。因此,NDRG1基因在胆囊癌中具有重要意义并有可能作为新的治疗靶点。