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厌氧消化是秸秆资源化的重要途径,水解过程是该途径的主要限速步骤。沼液沼渣,厌氧污泥,畜禽粪便等是常见的接种物来源,但是由于缺乏合适的环境选择压力,往往无法形成高效水解菌群。为此本研究通过添加厌氧污泥到瘤胃微生物中构建共培养菌群,分别在批次和半连续模式下考察强化秸秆厌氧消化的过程;借助于分子生态学,金属形态分布特征以及三维荧光光谱-平行因子分析技术(EEM-PARAFAC)等手段,阐明其微生物学机制,并分析秸秆原料消化体系运行失稳的影响因素。主要结论如下:半连续条件下,有机负荷(OLR)为1.5 g/(L·d),3.5 g/(L·d)和7 g/(L·d)时,共培养体系比单瘤胃体系甲烷产率分别提高了1.79,2.07和2.26倍。沼气中的甲烷含量明显提高(p<0.05),在32-44%之间变动。共培养体系挥发性脂肪酸(VFAs)无积累,pH值维持在6.8-7.68之间;滤纸酶(FPase)和羧甲基纤维素酶(CMCase)酶活呈增加趋势,显著高于对照体系(p<0.05)。厌氧消化后,甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)成为优势菌属,来自于污泥的甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)成为第二大菌属。共培养水解菌群结构变化明显,梭状芽孢杆菌属(Clostridium)仍是优势菌属,但瘤胃球菌属(Ruminococcus)提高显著。来源于瘤胃的拟杆菌属(Bacteroides),纤维杆菌属(Fibrobacter)和醋弧菌属(Acetivibrio)从体系中消逝。共培养体系中Ruminococcus与Methanobrevibacter功能菌群的协作实现了水解和产甲烷活性的提高。在瘤胃菌群(RM)和厌氧污泥(AS)接种比分别为1:1,1:2,2:1,1:0和0:1(挥发性固体VS比)的条件下,研究稻秸的厌氧消化特性。共培养体系(接种比1:1,1:2,2:1)稻秸的甲烷产率提高了三倍左右。在接种比为1:1时有最高甲烷产率273.64 mL/g VS,达到了理论产值的78.21%。共培养显著提高了木聚糖酶和纤维素酶活性(p<0.05),使降解率在43.95%-44.64%之间变动,是稻秸高效降解的关键。厌氧消化后,共培养菌群结构变化明显。固相中纤维素水解菌主要来自梭菌目(Clostridiales),包括了多糖降解菌(Proteiniclasticum,Lutispora)和产乙酸菌(Tissierella,Sedimentibacter)的协同代谢,而半纤维素降解菌隶属芽孢杆菌属(Lysinibacillus)。水解菌和嗜乙酸型甲烷菌(Methanosarcina和Methanosaeta)共存于稻秸残渣上。液相中甲烷丝菌属(Methanosaeta)与互营杆菌属(Syntrophobacter)或消化肠状菌属(Pelotomaculum)形成互营氧化菌群减少丙酸积累,加快了厌氧消化的启动时间。利用混合秸秆作为原料,研究半连续条件下不同OLR和回流比的厌氧消化特性。在OLR为4 g/(L·d),回流比为1:1时,最大甲烷产率为217 mL/g VS,达到了理论产值的56-58%。稳定阶段,干物质降解率在79.86%-88.81%之间变动。秸秆水解菌主要属于Clostridiales;发酵产酸菌主要来自毛螺菌科(Lachnospiraceae)及拟杆菌目(Bacteroidales);产乙酸菌主要来自螺旋体科(Spirochaetaceae)和Clostridiales;互营氧化菌包括了互养菌门(Synergistete)菌属,丙酸氧化菌(Syntrophobacter和Pelotomaculum),丁酸氧化菌(Syntrophus和Syntrophomonas)。总甲烷菌,嗜氢型甲烷杆菌目(Methanobacteriales)和嗜乙酸型球菌目(Methanosarcinales)数量升高,分别达到了6.20×108拷贝数/m L,3.30×108拷贝数/mL,1.75×10~7拷贝数/m L。当OLR升高到6g/(L·d)时,溶解性有机物(DOM)浓度升高到13.67 g/L。失稳阶段沼渣中Zn和Fe可利用态浓度显著下降(p<0.05),分别为4.39 mg/kg,5.54 mg/kg。Cu和Ni的可利用态浓度分别下降为0.40 mg/kg,1.33 mg/kg。Mo的可利用态浓度为0.98 mg/kg。体系总甲烷菌和Methanobacteriales数量分别为8.56×105拷贝数/mL,4.14×103拷贝数/mL,含量显著下降(p<0.05),产甲烷活性降低。菌群结构多样性降低,秸秆水解菌和互营氧化菌含量下降;而发酵产酸菌Bacteroidales含量显著升高(p<0.05)。丁酸积累,乙酸和丙酸浓度分别达到了2.02 g/L和6.54 g/L,系统出现“酸败”现象。考察了批次条件下高含固率和物种比(F/I)对稻秸厌氧消化特性的影响,结果表明甲烷产率随着含固率的升高呈下降趋势。当含固率为20%,F/I为2和6时,产甲烷迟滞期(λ)分别为6.24 d和9.16 d。PARAFAC模型确定荧光组分数为2,其中辅酶F420与甲烷产率显著性相关(p<0.01),可以用来表征产甲烷活性。在高固态半连续消化中,容积产气率最高达到了1.04 L/(L·d)。当OLR为2.26 g/(L·d)时,甲烷含量稳定在54.39%左右,甲烷产率均值为280.90 m L/g VS,达到了稻秸理论产值的80.29%。同时卧式反应装置中纤维素酶活性提高,有利于纤维素的降解。PARAFAC模型确定荧光组分数为3,其中辅酶F420和NADH荧光强度分别反映了产甲烷活性和厌氧消化效率的变化。当OLR升高到2.47 g/(L·d)时,氨氮浓度均值达到了1082.63 mg/L。嗜氢型Methanobacteriales数量下降到1.04×10~6拷贝数/g TS,嗜乙酸型Methanosarcinales数量增加到9.44×10~6拷贝数/g TS,产甲烷途径发生了适应性变化。辅酶F420表征的产甲烷活性降低,反应装置中丙酸开始出现积累。