人肝脏线粒体乙醛脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase2,ALDH2)能催化乙醛氧化为乙酸,在人体乙醛解毒方面有潜在的应用价值。而且,在心绞痛、心肌梗塞和心力衰竭的治疗中,ALDH2也起重要的催化功能,使硝化甘油转化为硝酸盐和1,2-二硝酸甘油。因此,在将来的临床治疗中人ALDH2会有重要应用。　　 本论文克隆了人的ALDH2*1 cDNA,并在毕赤酵母中进行表达,对其功能进行了初步研究。为比较不同物种ALDH的性质和功能的区别,还筛选了两株ALDH活性较高的菌株,克隆了一株细菌中与人ALDH2很类似的辅酶NAD+依赖型ALDH基因,在大肠杆菌中进行表达,并对重组酶的基本酶学性质进行了研究,探讨了其功能。　　 选用毕赤酵母Pichia pastoris GS115表达人ALDH2。基于ALDH2*1 cDNA序列信息,通过选择毕赤酵母偏好的密码子和降低序列GC含量对ALDH2 cDNA序列进行了改造。设计好的序列利用重叠延伸PCR技术进行了人工合成。然后将该cDNA克隆到质粒pPIC9K中,重组载体电转化至P.pastoris GS115中,构建重组菌株。该重组菌株在三角瓶中培养后,发酵液中的分泌蛋白量为80mg/L,而含有原始人ALDH2*1cDNA的重组菌株在三角瓶中培养得到的重组蛋白产量仅为16mg/l。　　 对重组菌株进行了进一步的摇瓶表达条件优化和发酵罐发酵研究。摇瓶培养的最优条件是:25℃低温培养、诱导表达培养基BMMY的起始pH7.0、诱导初始菌体密度为干重4.5g/L、诱导表达60h、诱导过程中每24h补甲醇浓度为1.2％(v/v)。高密度发酵基本工艺是:甘油做碳源培养阶段,初始甘油浓度为40g/L,培养约23h后甘油耗尽,按9-11mL/L/h流加500ml含有50％甘油和1.2％(v/v)PTM1微量盐的溶液。流加结束后,菌体浓度达74g/L干重。饥饿1h左右,然后开始甲醇流加,甲醇流加量逐渐从1mL/L/h提高至约15mL/L/h,并与溶解氧关联。整个发酵过程溶氧均控制不低于20％。诱导表达72 h后,收集培养液上清,分泌蛋白的量大约是每升发酵液260mg,重组蛋白纯化后ALDH2的比酶活是1.2 U/mg。　　 对前述发酵液中分离纯化的重组蛋白在解救小鼠急性酒精中毒中的作用进行了初步研究,检测了小鼠的醉酒时间和醒酒时间,以及肝脏和血液中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平。结果发现在给小鼠灌酒之前用人ALDH2或用ADH和人ALDH2混合酶液灌胃可以延缓小鼠的醉酒,并加快其醒酒:灌胃人ALDH2的小鼠和灌胃ADH与人ALDH2混合液的小鼠的转氨酶水平均显著低于没给药的小鼠,并且仅略高于空白对照组的正常小鼠。表明该重组人ALDH2具有明显解酒效果,且对小鼠的肝脏起到了一定保护作用。上述研究为下一步乙醇和乙醛解毒产品的产业化开发奠定了良好基础。　　 从土壤中筛选得到了ALDH酶活性较高的两个菌株,该菌株在含诱导剂0.7％乙醇的肉膏蛋白胨培养基中生长良好并显示较高的ALDH酶活性。生理生化实验结果和核酸序列分析鉴定均为不动杆菌属Acinetobacter菌株,并发现16-23S rDNA间隔序列可有效用于不动杆菌的分类鉴定。克隆得到了Acinetobacter sp.HBS-2的辅酶NAD+依赖型ALDH基因,基因全长1467 bp,分析发现该基因是一个未曾报道的基因。将该基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并在E.coli BL21中进行了表达。重组蛋白的性质明显区别于已报道的微生物的ALDH,锰离子对该重组酶有较强激活作用。将根据基因序列推知的表达产物的氨基酸残基序列在GenBank中进行了BLAST分析,结果发现该蛋白质的一级序列与A.baumannii17978菌株中与致病有关的ALDH高度相同,且与人肝脏线粒体依赖NAD+的ALDH2的保守序列高度一致。推测该菌株有两种以上依赖NAD+的ALDH基因和蛋白质,乙醇氧化和乙醇介导的致病途径可能是由不同的ALDH催化的,本研究克隆得到的基因产物可能与该菌株的致病性有关。本研究为今后有关乙醇的信号途径及ALDH参与不动杆菌致病机理的研究打下了基础。