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目的:近年来发现内皮细胞被激活或凋亡时可以形成和释放微囊泡(endothelial microvesicles,EMVs)。EMVs携带细胞因子、蛋白质、RNA、DNA等多种生物活性物质,可将生物信息传递到靶细胞,触发靶细胞发生一系列的反应。EMVs在凝血、炎症反应和调节细胞内信号传导等方面发挥着重要作用。本文拟研究缺氧/复氧法诱导内皮细胞释放的微囊泡(H/R-EMVs)对H9c2细胞凋亡和氧化损伤的作用及机制。探讨其对PI3K/Akt、ERK1/2、p38MAPK、JNK信号通路的影响,并检测H/R-EMVs的MMP-2活性和ROS含量。这些将为心肌缺血/再灌注损伤机制研究开辟新的方向。方法:1.H/R-EMVs的分离提取和鉴定HUVECs常规培养24 h。换用缺氧液并在95%N2-5%CO2条件下缺氧培养12 h后,再复氧4 h。收集培养上清液,采用梯度离心的方法分离提取H/R-EMVs。应用1 μm标准微球和PE-CD144抗体,采用流式细胞仪对H/R-EMVs进行鉴定;采用BCA法进行蛋白定量分析测定H/R-EMVs浓度。2.H/R-EMVs对H9c2细胞凋亡、氧化损伤的作用及其对PI3K/Akt、ERKI/2、p38MAPK、JNK信号通路的影响H9c2细胞常规培养24 h后分为4组。①Control组换用无血清的高糖DMEM培养6 h;②-④组为:H/R-EMVs 10、30和60组,用终浓度分别为10、30和60 μg/mL的H/R-EMVs与细胞共孵育6 h。采用MTT法检测细胞存活率;Hochest 33258染色、FITC-Annexin V/PI双染、caspase-3活性检测细胞凋亡;Western blot检测H9c2细胞中Bcl-2和Bax的表达水平。采用比色法分别检测包括H9c2细胞培养液中LDH活性、细胞内T-SOD和MDA的含量;流式细胞仪检测H9c2细胞内ROS的含量。Western blot检测H9c2细胞中p-Akt/t-Akt、p-ERK1/2/t-ERK1/2、p-p38MAPK及p-JNK1/2蛋白表达的水平。3.H/R-EMVs携带的MMP-2活性和ROS含量检测HUVECs常规培养24 h后分为2组。Control组用缺氧对照液培养HUVECs 16小时,H/R组用缺氧液并在95%N2-5%CO2条件下缺氧处理12h后,再复氧4h。收集培养上清液,采用梯度离心的方法分离提取Control-EMVs(C-EMVs)和H/R-EMVs。采用明胶酶谱法对MMP-2活性进行检测。采用流式细胞仪对两种EMVs的ROS含量进行检测。结果:1.H/R-EMVs的分离提取和鉴定流式检测结果证实H/R能够诱导HUVECs释放得到粒径小于1 μm且CD144+的微囊泡,即 H/R-EMVs。H/R-EMVs 蛋白浓度为 0.346±0.085 μg/μL。2.H/R-EMVs对H9c2心肌细胞凋亡、氧化损伤的作用及其对PI3K/Akt、ERK1/2、p38MAPK、JNK信号通路的影响与Control组比较,H/R-EMVs 30和60组细胞存活率显著降低(89.70±5.26%,78.74±7.87%vs.100±0%,P<0.05 或P<0.001):其中 H/R-EMVs 60 组细胞凋亡率显著升高(18.71±2.81%vs.6.90±0.77%,P<0.01),并且 caspase-3 活性显著增加(294.14±28.03 vs.140.33±29.43,P<0.01)。Hoechst 染色结果显示随 H/R-EMVs 浓度的升高,细胞核凝聚呈致密浓染,可见细小不规则颗粒状,细胞碎片增多。Western blot结果显示,与Control组比较,H/R-EMVs能浓度依赖性下调Bcl-2/Bax蛋白比值,其中H/R-EMVs 30和60组作用明显(P<0.001)。与Control组比较,H/R-EMVs 60组LDH活性显著升高(142.56±9.67 vs.109.23±6.54,P<0.001)并且 MDA 含量显著升高(2.80±0.40 vs.1.81±0.44,P<0.0I),H/R-EMVs 30 和 60 组 T-SOD 活性显著降低(46.50±2.78,32.97±2.63 vs.62.66±3.40,P<0.001)。ROS含量的平均荧光强度随H/R-EMVs浓度依赖性升高,其中 H/R-EMVs 60 组的荧光强度最强(8.23±0.184 vs.7.51±0.16,P<0.01)。Western blot结果显示,H/R-EMVs浓度依赖性下调H9c2细胞中p-Akt的表达水平(P<0.01或P<0.001);H/R-EMVs 30和60组p-ERK1/2蛋白的表达水平明显下降(P<0.05);但是H/R-EMVs30 和 60 组 p-p38MAPK(P<0.01)和p-JNK 1/2(P<0.01)蛋白表达水平却明显升高。3.H/R-EMVs中MMP-2活性的检测明胶酶谱结果显示,与Control组比较,H/R组MMP-2活性明显升高(110.94±4.12 vs.100±0,P<0.05);在H/R组中,与超离后上清比较,H/R-EMVs显示有更高的MMP-2活性(175.85±20.06 vs.100±0,P<0.01)。4.H/R-EMVs中ROS含量的检测流式检测结果显示,与C-EMVs比较,H/R-EMVs中ROS含量的平均荧光强度明显升高(639.83±41.03 vs.453.67±20.42,P0.001)。结论:H/R法可诱导HUVECs释放H/R-EMVs,其蛋白浓度为0.346±0.085μg/μL。60μg/mL H/R-EMVs通过下调Bcl-2/Bax的比值发挥促H9c2细胞凋亡的作用。60μg/mL H/R-EMVs引起H9c2细胞的氧化损伤。10,30,60 μg/mL H/R-EMVs剂量依赖性下调H9c2细胞中p-Akt和p-ERK1/2的蛋白水平,上调p-p38MAPK和p-JNK1/2的水平。此外,H/R-EMVs携带有MMP-2,H/R-EMVs中的ROS含量也较高。