研究背景和意义:结直肠癌(CRC)仍然是一个重要的全球性健康问题,2008年在全球范围内有120多万新发结直肠癌病例和60多万与其相关的死亡病例。近年来,随着经济的发展、人民生活水平的提高以及饮食结构的改变,我国CRC的发病率呈逐年上升趋势,且CRC发病比较隐匿,往往在发现时肿瘤己处于进展期甚至晚期阶段,这就给临床治疗带来许多的困难,不利于改善患者的预后。到目前为止,由于手术技术的进步以及放疗、化疗和靶向治疗的结合,CRC患者的预后有了显著的改善。然而,对于晚期CRC患者和局部复发或远处转移的患者,预后仍然很差。因此,科学家一直致力于探索CRC的病因并提高其临床疗效的研究,期望能够改善CRC患者的生存率。目前研究表明,CRC的发生发展是一个复杂的过程,它涉及多种因素、多个阶段以及多个基因的改变和协同作用,其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是CRC发生与发展的重要特征。目前研究已经显示,CRC的发生发展、侵袭转移过程涉及到多个相关基因的改变,但其机制复杂,尚未完全明了。因此,有必要研究CRC发生、发展和转移的分子机制和关键调控因子,从而为预测肿瘤发生、局部复发或远处转移提供相应的生物标志物,这样我们才能更好地选择治疗策略,最终改善患者的预后。DNA甲基化通过抑制某些抑癌基因的表达来影响肿瘤的进程,而DNA去甲基化则可以激活某些癌基因或抑癌基因的表达。DNA羟甲基化是一种主动去甲基化的修饰过程,TET(Ten eleven translocation)是加双氧酶家族的成员,是DNA羟甲基化的调控酶,能将5-甲基胞嘧啶(5-mC)转化为5-羟基甲基胞嘧啶(5-hmC),并导致CpG岛的去甲基化。TET蛋白的缺失或突变以及与其伴随的5-hmC含量的下调在各种人类癌症中都很常见。研究发现,TET1在乳腺癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌中通常不存在。此外,有报道称,在结肠癌的起始阶段,TET1在癌细胞中表达下调,从而导致WNT通路抑制剂的启动子被抑制,其结果是导致了WNT通路的本构激活。然而,导致这一重要的肿瘤抑制因子在CRC下调的机制尚需进一步阐明。MicroRNA(miRNA)是一种内源性非编码的单链小RNA,广泛存在于生物基因组中。它能与目标mRNA的3’非翻译区域(3’-UTRs)进行配对并结合,不完全降解mRNA或抑制mRNA的翻译,参与调控了一半以上的基因表达。此外,miRNA是重要的转录后调节因子,在细胞增殖、分化、凋亡、组织发育、肿瘤发生等生理过程中发挥着广泛而重要的作用。鉴于之前的研究表明TET1参与抑制CRC细胞的生长,我们假设TET1在转录后水平上受miRNA调控。在我们的研究中,我们发现与CRC患者的癌旁邻近组织样本相比,CRC患者的癌组织样本中miR-21的表达上调,而TET1的表达明显下降。此外,我们的研究结果表明,miR-21通过靶向作用于TET1促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭与迁移。第一部分结直肠癌组织中miR-21和TET1的表达情况及二者相关性研究目的研究结直肠癌组织中miR-21和TET1的表达情况及相互关联方法采用生物信息学的方法预测miR-21可靶向作用于TET1。收集2016-2017年间在山东大学附属省立医院胃肠外科由同一手术团队确诊并行根治性手术的结直肠癌患者50例。取其肿瘤组织细胞及对应的切缘肿瘤检测阴性的正常结直肠组织细胞,采用新鲜冰冻样本进行miR-21和TET1表达分析。使用qRT-PCR分析50对临床CRC和邻近的非癌组织中miR-21和TET1 mRNA的表达情况,并通过内源性对照对其进行标准归一化处理,分析二者表达差异,并进一步评估了 miR-21和TET1表达之间的相关性。结果目前用于预测miRNA靶基因的网站软件有很多,如miRBase、TargetScan和starbase等,我们选择在线应用多个生物信息学预测软件对miR-21的靶基因进行预测,将3各数据库的预测结果取交集,预测得出miR-21可信度和准确性较高的靶基因。结合既往的研究结果,选择其中最有可能并且与肿瘤有一定关系的一个靶基因进行验证。我们筛选出的靶基因为TET1。然后,我们使用qRT-PCR分析50对临床CRC和邻近的非癌组织中TET1 mRNA的表达,并参照内源性对照(GAPDH)进行标准归一化处理。结果显示,与相应的邻近组织相比,50例CRC患者的肿瘤组织中TET1 mRNA的表达水平较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。我们同样检测了 miR-21的表达水平,发现CRC患者的肿瘤组织中miR-21的表达水平较对应的邻近组织高,差异同样具有统计学意义(P<0.05)。然后我们评估了 miR-21和TET1 mRNA相对表达水平之间的相关性。不出所料,我们发现在CRC组织中miR-21水平与TET1 mRNA水平呈显著负相关(Pearson相关系数r=-0.409,P=0.0032)。总的来说,我们的发现表明,与相应的邻近组织相比,50例CRC患者的肿瘤组织中TET1 mRNA表达水平较低,而miR-21的表达水平较高。同时,我们发现miR-21水平与TET1mRNA水平呈显著负相关。结论与相应的邻近组织相比,结直肠癌组织中miR-21高表达而TET1 mRNA低表达,且二者表达水平呈显著负相关。第二部分体外实验证实TET1是miR-21的靶基因及其调控关系研究目的体外实验证实miR-21可靶向作用于TET1 mRNA的3’-UTRs,抑制CRC细胞中TET1的表达。方法将预测与miR-21相互作用的TET1 mRNA的3’-UTRs序列或与预测目标位点相互作用的突变序列插入pmirGLO载体中(Promega,USA)。它们分别被命名为 pmirGLO-TET1-wt 和 pmirGLO-TET1-mut。向结直肠癌细胞株 HCT15 和 HT29共转染 hsa-miR-21 mimics(miR-21)/NC(miR-control)和 pmirGLO-TET1-wt/pmirGLO-TET1-mut,使用荧光素酶检测设备检测转染后细胞的荧光素酶活性,根据检测结果判断miR-21与TET1 mRNA的3’-UTRs是否相结合。为了进一步研究miR-21对TET1表达的影响,我们在HCT15和HT29细胞中进行了 miR-21和抗miR-21的瞬时转染,使用qRT-PCR分析转染后miR-21和TET1 mRNA的表达情况。同时,我们使用蛋白印迹的方法检测转染后TET1蛋白的表达水平。结果荧光素酶报告基因分析显示,在HCT15细胞中miR-21与pmirGLO-TET1-wt 反应组较其余三组(miR-21 与 pmirGLO-TET1-mut 组、miR-contro1 与 pmirGLO-TET1-wt 组、miR-control 与 pmirGLO-TET1-mut 组)的萤火虫荧光素酶活性明显偏低(P<0.05),而其余三组无明显差异。在HT29细胞中也产生了同样的实验结果。实验表明miR-21以剂量依赖性的方式显著抑制pmirGLO-TET1-wt的萤火虫荧光素酶活性,而当靶位点在HCT15和HT29细胞中发生突变时,miR-21则不能发挥作用,这就证实了 miR-21可靶向作用于TET1mRNA的3’-UTRs。瞬时转染实验的数据显示,与对照组HCT15和HT29细胞中的miR-21相比,实验组在转染miR-21后引起miR-21表达上调,并导致TET1 mRNA水平明显降低,而转染抗miR-21后引起miR-21表达下调,并导致TET1 mRNA水平明显升高。当CRC细胞中miR-21的表达升高时,TET1蛋白水平显著降低,而抑制两种CRC细胞中miR-21的表达时,TET1蛋白水平显著升高。总的来说,我们的实验表明,在CRC细胞中miR-21可靶向作用于TET1 mRNA的3’-UTRs并引起TET1的表达下调。结论TET1是CRC细胞中miR-21的一个靶基因,miR-21能够引起CRC细胞中TET1的表达下调。第三部分MiR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响目的探讨miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响方法根据之前研究结果,miR-21能够下调CRC细胞中的TET1表达。而最近的研究发现,与正常组织相比,在结直肠肿瘤组织中,TET1表达显著减少,癌细胞的扩散与TET1的沉默有关。因此,我们进一步研究miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响。我们通过向CRC细胞转染抗miR-21,降低miR-21的表达而抬高TET1表达,然后再转染si-TET1从而敲低TET1的表达,研究细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化。本实验在两种结直肠癌细胞株HCT15和HT29中转染抗miR-21、抗miR-21+ si-TET1及相应对照,使用qRT-PCR方法检测转染后各组miR-21和TET1 mRNA表达水平,使用Western blot检测TET1蛋白表达水平。然后选用EdU检测和CCK-8分析验证miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的增殖能力的影响,选用Transwell实验验证miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的侵袭能力的影响,选用细胞划痕实验验证miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的迁移能力的影响。结果在两种结直肠癌细胞株HCT15和HT29中转染抗miR-21、抗miR-21+si-TET1及相关对照后使用qRT-PCR、Western blot检测各组miR-21和TET1表达水平及TET1蛋白表达水平。结果显示在两组CRC细胞株中转染抗miR-21组细胞较对照组miR-21表达下调,TET1 mRNA水平明显升高,TET1蛋白表达水平升高;转染抗miR-21+si-TET1组细胞较对照组miR-21表达下调,TET1 mRNA和TET1蛋白表达水平均无明显差异,而较抗miR-21组细胞TET1 mRNA和TET1蛋白表达水平均明显降低。实验表明抗miR-21转染后降低了 miR-21的表达,上调了 TET1的表达;而同时转染抗miR-21+si-TET1后降低了 miR-21的表达,但TET1的表达无明显上调。细胞转染达到了预期效果后,我们进一步检测转染后细胞生物学行为的变化。EdU检测显示,抗miR-21组细胞较对照组及抗miR-21+ si-TET1组细胞增殖明显降低(P<0.05),而抗miR-21+si-TET1组细胞与对照组细胞增殖能力无统计学差异。CCK-8分析表明,在HCT15和HT29细胞中使用抗miR-21处理后,CRC细胞的增殖能力较对照组显著降低,而对照组和用抗miR-21+si-TET1同时处理组则无统计学差异。Transwell实验表明,抗miR-21处理后细胞侵袭能力较对照组显著降低,而对照组和用抗miR-21+si-TET1同时处理组则无统计学差异。细胞划痕实验表明,抗miR-21处理后细胞迁移能力较对照组显著降低,而对照组或用抗miR-21+si-TET1同时处理组则无统计学差异。实验结果说明在两种结直肠癌细胞株HCT15和HT29中,抗miR-21处理后TET1高表达使得细胞增殖、侵袭及迁移能力均降低,但通过同时与抗miR-21和si-TET1作用使得TET1低表达,可以抵消抗miR-21介导的HCT15和HT29细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。实验结果表明miR-21影响细胞增殖、侵袭和迁移部分依赖于TET1的作用。结论miR-21可以通过靶向作用于CRC细胞中的TET1来促进细胞增殖、侵袭及迁移。