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喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，98％以上为喉鳞状细胞癌，其发病率呈逐年上升趋势，在我国东北地区高发，且以声门上型喉鳞状细胞癌(supraglotticLaryngeal squamous cell carcinoma, SGLSCC)发病率高，常出现颈部淋巴结转移。颈部淋巴结的转移和局部复发是影响喉癌患者治疗和预后的重要因素。因此，进一步研究SGLSCC发生转移的分子生物学机制，发现其肿瘤转移标志物，对于SGLSCC的预防、诊断、治疗、预后评价和化疗药物选择将有重要意义。 目前研究发现，乳腺癌转移抑制基因BRMS1(breast cancer metastasissuppressor1，BRMS1)作为肿瘤转移抑制基因的一员，它的表达下调或缺失可促进多种恶性肿瘤的转移。我们前期工作通过RT-PCR方法研究发现，BRMS1基因mRNA在SGLSCC组织中的表达存在明显下调，并且BRMS1基因mRNA的表达下调与声门上型喉癌的P-TNM分期、病理分级和颈部淋巴结转移密切相关。故本研究继续探讨在SGLSCC中BRMS1蛋白的表达情况以及BRMS1基因启动子区域甲基化情况，探讨BRMS1基因启动子甲基化与其基因表达的相关性;检测肿瘤转移相关因子CD44v6蛋白在SGLSCC中的表达情况;对70例SGLSCC患者进行临床随访，综合临床随访资料探讨SGLSCC组织中肿瘤转移抑制基因BRMS1蛋白和肿瘤转移相关因子CD44v6蛋白表达的相关性及二者在SGLSCC临床诊断、治疗以及颈部淋巴结转移和预后中的价值，从而为SGLSCC的颈部淋巴结转移潜能及预后判定提供科学依据。 材料与方法: 一、实验材料 随机收集选取中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科2003年9月-2007年9月之间行手术治疗的原发性SGLSCC组织原发灶70例、其相邻的癌旁正常喉黏膜组织（为术中所取安全缘，距癌组织边缘0.5-1.0 cm以外的癌旁正常喉黏膜组织，均经病理检查证实）标本60例，和颈部淋巴结转移灶标本44例。其中男61例，女9例;年龄37-84岁，平均年龄57.6岁。G1高分化鳞癌43例，G2中分化鳞癌18例，G3低分化鳞癌9例。术后病理P-TNM分期按2002年UICC标准:Ⅰ期0例，Ⅱ期14例(T2N0M014例)，Ⅲ期26例(T2N1M05例、T3N0M09例、T3N1M012例)，Ⅳ期30例(T2N2aM02例、T2N2bM04例、T3N2aM05例、T3N2bM010例、T3N2cM03例、T4N0M03例、T4N1M01例、T4N2bM01例、T4N2cM01例)。 二、实验方法 (一)Westem blotting法检测SGLSCC组织原发灶、癌旁正常喉黏膜组织和颈部淋巴结转移灶中BRMS1蛋白的表达情况。 （二）免疫组化法检测BRMS1蛋白和CD44v6蛋白在SGLSCC组织原发灶、癌旁正常喉黏膜组织和颈部淋巴结转移灶中的表达以及亚细胞定位情况。 （三）甲基化特异聚合酶链反应(Methylation-specific polymerase chainraction，MSP)法检测在SGLSCC组织原发灶、颈部淋巴结转移灶和癌旁正常喉黏膜组织中的RMS1基因启动子区域甲基化情况。 （四）随访:本组病例均坚持详细系统的术后临床随访，包括术后定期门诊复查以及电话术后跟踪随访等，其中失访2例，失访率2.9％。随访截止日期为2008年10月30日。 （五）统计学分析:应用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差((x)±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，如有差异，多组间的两两比较采用q检验;计数资料采用x2检验;相关性分析采用Spearman秩相关分析。以Kaplan-Meier法计算术后累积生存率，Log Rank法检验各组间的差异。P＜0.05说明对比组之间的差异具有统计学意义。 结果: 一、Western blotting检测BRMS1蛋白在声门上型喉癌组织中表达 Western blotting检测发现声门上型喉癌原发灶、癌旁正常喉黏膜组织和颈部淋巴结转移灶均有BRMS1蛋白表达，BRMS1蛋白表达值分别为72.46±6.58，118.83±25.86和43.67±4.24，三组参数经单因素方差分析，发现差异具有统计学意义，三组参数间的两两比较经q检验，发现差异具有统计学意义(P＜0.05)。同时通过比较SGLSCC组织中BRMS1蛋白表达与BRMS1mRNA的表达情况，BRMS1蛋白表达下调水平与其mRNA表达下调水平一致(rs=0.86，P＜0.01)。 二、免疫组化检测BRMS1蛋白的表达 免疫组化发现BRMS1蛋白表达定位于细胞核和细胞浆内，弥漫性分布，呈黄色至深棕色颗粒。BRMS1蛋白在癌旁正常喉黏膜组织中呈阳性和强阳性表达，阳性表达率100％(60/60);在SGLSCC组织原发灶中BRMS1蛋白染色的阳性细胞数量及强度较癌旁正常喉黏膜组织明显减少及降低，阳性表达率为35.7％(25/70)，阴性表达率为64.3％(45/70);在颈部淋巴结转移灶中均为阴性。经统计学分析,差异有统计学意义(P＜0.01)。在SGLSCC中BRMS1蛋白表达下调，且其表达与声门上型喉癌的P-TNM分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关(P＜0.01)。 三、MSP法检测SGLSCC中BRMS1基因启动子甲基化 MSP法检测BRMS1基因启动子区甲基化，发现在70例SGLSCC原发灶中检测到34例RMS1基因启动子区甲基化，且此34例均为免疫组化BRMS1蛋白阴性表达病例，44例颈部淋巴结转移灶中检测到32例BRMS1基因启动子区甲基化，而44例颈部淋巴结转移灶均为BRMS1蛋白阴性表达，60例癌旁正常喉黏膜组织中均未检测到RMS1基因启动子区甲基化，结果表明在SGLSCC中BRMS1基因启动子甲基化与其基因表达下调密切相关(rs=0.66，P＜0.05)。 四、免疫组化检测SGLSCC中CD44V6蛋白的表达特点 免疫组化检测CD44V6蛋白表达定位于细胞膜，呈黄色至深棕色颗粒，弥漫性分布。CD44V6蛋白在SGLSCC组织中呈阳性和强阳性表达，阳性表达率82.9％(58/70);在癌旁正常喉黏膜组织中均为阴性表达，无阳性表达;在颈部淋巴结转移灶组织中均呈阳性表达，阳性表达率100％(44/44)，差异有统计学意义(P＜0.01)。CD44v6蛋白在SGLSCC组织中高表达，其蛋白表达与声门上型喉癌的P-TNM分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关(P＜0.01)。 五、BRMS1蛋白和CD44V6蛋白在SGLSCC组织中表达的相关性及与预后关系 经统计学分析表明，在声门上型喉癌组织中，BRMS1蛋白和CD44V6蛋白的表达呈负相关(rs=-0.59，P＜0.01)。Kaplan-Meier法计算70例声门上型喉癌患者术后累积生存率，BRMS1蛋白阳性表达组病例3年累积生存率为78.2％，BRMS1蛋白阴性表达组病例为75.3％，二者之间的差异无明显统计学意义(LogRank检验，P＞0.05)。而CD44v6蛋白阳性表达组病例3年累积生存率为58.7％，CD44v6蛋白阴性表达组为80.3％，二者之间的差异有统计学意义(Log Rank检验，P＜0.05)。 结论: 1、在声门上型喉癌组织中BRMS1蛋白的表达下调，该基因蛋白表达下调水平与其mRNA表达下调水平一致。BRMS1蛋白的表达下调与声门上型喉癌的P-TNM分期、病理分化程度和颈部淋巴结转移密切相关。 2、BRMS1基因启动子甲基化与声门上型喉癌组织中BRMS1基因表达下调相关，BRMS1基因启动子甲基化可能是声门上型喉癌组织中BRMS1基因表达下调的原因之一。 3、CD44v6蛋白在声门上型喉癌组织中存在细胞膜的高表达，CD44v6的表达与声门上型喉癌临床P-TNM分期、病理分化程度、颈部淋巴结转移以及预后密切相关。 4、声门上型喉癌组织中BRMS1蛋白表达与CD44v6基因蛋白表达呈负相关。