西黄丸是一则中药复方方剂,为清代名医王洪绪所创,首见于《外科证治全生集》。由牛黄、麝香、乳香和没药四味中药组成,具有清热解毒,消肿散结的功效。在古代常用来治疗乳岩、瘰、痰核、肺痈、小肠痈等炎性恶疾,在现代常用来辅助治疗肿瘤疾患。研究传统复方西黄丸治疗抗癌的分子机制,对于推广和拓展其临床应用十分必要,也对挖掘祖国中药宝库具有重要的意义。乳腺癌是临床上最常见的女性恶性肿瘤之一。其致死率逐年增加。乳腺癌的常规治疗方法包括手术、放射治疗和化疗。紫杉醇是临床上常用的乳腺癌化疗方案,最初用于包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的治疗具有十分显著的疗效;但随着其广泛的应用,乳腺癌对其耐药的矛盾日益突出。临床上西黄丸辅助治疗乳腺癌,具有增加化疗反应率,减少不良反应和延长患者生存期的作用;但具体的分子机制尚不明确。肿瘤干细胞理论的提出为化疗耐药的发生提供了一个新的思路。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤生长是由隐藏在癌症中极少数的肿瘤干细胞所驱动,具有多项分化、自我更新和耐药等基本特征。这使得肿瘤干细胞(CSC)难以被化疗药物杀灭,相反,在化疗药物杀死大量普通肿瘤细胞时,反而将肿瘤干细胞富集,分化成耐药且更具侵袭性的肿瘤细胞。这也就解释了临床观察到在首次放化疗成功后,肿瘤常常出现复发、肿瘤休眠和转移的现象。西黄丸延缓乳腺癌化疗耐药与肿瘤干细胞之间是否存在着一定的联系,这值得我们进一步的研究。近年来,西医也认可了炎症与肿瘤的密切关系,2011年,著名学者Weinberg将炎症列入肿瘤“新十大特征”之一,选择性抗炎药也被列为肿瘤治疗的新方向。有研究者发现,非留体类抗炎药是通过环氧合酶-2/前列腺素E2(COX-2/PGE2)等炎症通路,抑制肿瘤干细胞来实现抗癌的作用。化疗在杀死大量普通的肿瘤细胞时,濒死的肿瘤细胞分泌出大量的PGE2,激活肿瘤干细胞,分化成耐药且更具侵袭性的肿瘤细胞。因此PGE2及其下游的炎症通路和肿瘤干细胞与化疗耐药性具有密切的关联,对它们的动态变化的研究十分重要,抑制PGE2炎症通路可能抑制肿瘤干细胞的激活,进而延缓化疗耐药的发生。现代药理学研究表明,西黄丸的组成药材乳香和没药的成分具有强烈的抗炎作用。这提示我们:应当重点研究西黄丸对PGE2炎症通路的影响及其可能的机制,同时也为阐述西黄丸抗癌机理、联用化疗药的协同药效的机理提供了重要的突破口。目的本实验旨在以炎症信号通路为切入点,考察传统中药西黄丸对PGE2、白细胞介素(IL)-6、IL-8、血管内皮生长因子(VEGF)等病理标志物的影响,探索西黄丸对乳腺癌干细胞的作用,为阐明西黄丸的临床价值提供依据和参考。方法西黄丸为成药,不能直接用于分子细胞实验,常用的提取方法包括水提液、煎液、动物血清等方式。高温煎液会导致麝香、乳香等药材中挥发性成分的损失;查阅文献发现,西黄丸低温浸液处理后,其提取物体外抑瘤效果较含药血清更为明显,因而本实验采用低温浸液进行体外研究。从同仁堂采购同一批号的西黄丸,参考文献方法,一次性获取大批量低温浸提液,混匀后分装冻存于-80℃备用。用色谱质谱技术鉴定西黄丸浸液中关键成分进行质量控制;用CCK8法检测人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,流式细胞术检测其凋亡;划痕实验检测MCF-7与MDA-MB-231的愈伤迁移能力;利用乙醛脱氢酶(ALDH)阳性比例和细胞成球实验检测乳腺癌干细胞数量,Western Blot检测上皮间质转变(EMT)标志物E-钙连蛋白(E-cadherin)和纤粘蛋白(Fibronectin)的表达;ELISA检测细胞上清中PGE2及IL-6、IL-8的分泌量,Western Blot检测信号转导和转录激活因子3(STAT3)磷酸化水平,RT-PCR检测IL-8、VEGF的基因水平。结果对比标准品与空白基质,发现西黄丸浸液供试品各成分分离良好,空白基质无干扰,与参考标准品对应的位置存在11-羟基-β-乙酰乳香酸以及胆红素的峰;各成分的二级质谱图对照品和供试品一致。说明实验所用西黄丸低温浸提液中含有乳香酸和胆红素这两种成分。这不仅保障了本课题所有实验的质量控制,为西黄丸浸液的质量提供了客观参考依据,而且为下一步对其成分的深入研究打下了良好的基础。单独用0、50、75、150μL/mL西黄丸浸提液处理MDA-MB-231细胞72h,可以显著抑制细胞的增殖(P<0.01),且具有剂量依赖性。不同浓度的西黄丸浸液联用10nM紫杉醇后,抑制增殖的效果优于单用紫杉醇;其中联用75 μL/mL、150μL/mL西黄丸浸液时,抑制效果更加显著(分别P<0.05,P<0.01)。单独用西黄丸浸液能抑制细胞的增殖;紫杉醇联合西黄丸浸液的抑制效果要优于单用紫杉醇。西黄丸浸液能促进细胞的凋亡,75μL/mL、150 μL/mL西黄丸浸液处理后凋亡细胞比例从空白对照组的6.375%分别上升到19.97%、36.38%,具有显著性差异(P<0.01)。10nM紫杉醇处理细胞72h后,凋亡占比23.95%;联用75μL/mL西黄丸浸液后,细胞凋亡比例仅比紫杉醇单独处理稍高,差异并不显著(P=0.69);而联用150 μL/mL西黄丸浸液后,细胞凋亡比例上升到31.82%(P<0.01)。单独用西黄丸浸液能诱导细胞凋亡;紫杉醇联用西黄丸浸液的效果要优于单用紫杉醇。正常培养情况下,MCF-7和MDA-MB-231都表现出了较强的愈伤迁移能力。尤其对照组MDA-MB-231在36h时划痕两侧细胞己迁移至中线位置,加入西黄丸浸液后细胞的迁移能力受到了明显的抑制;而MCF-7的迁移速度较慢,在72 h时划痕两侧细胞才开始接触,加入不同浓度的西黄丸浸液后,细胞的迁移同样也受到了抑制。这说明西黄丸浸液具有抑制细胞迁移的作用。流式细胞术检测乳腺癌干细胞标志物ALDH+细胞的比例。结果显示,西黄丸浸液可以降低由紫杉醇和多烯紫杉醇处理9%h后诱导升高的ALDH+细胞的比例,说明此时乳腺癌干细胞被富集;联用西黄丸浸液,则抑制紫杉醇或多烯紫杉醇诱导升高的ALDH+细胞的比例。说明西黄丸具有抑制乳腺癌干细胞的作用,同时也初步明确,紫杉醇诱导乳腺癌干细胞富集的化疗模型的作用时间为96 h。成球实验直接观察西黄丸浸液对乳腺球的影响。结果显示,75 μL/mL西黄丸浸液处理后,肿瘤球的数目从空白对照组的161个/5000cells下降到55个/5000cells,具有显著差异(P=0.007),并且球体直径明显减小;说明西黄丸浸液能抑制乳腺球的大小和数目,具有抑制乳腺癌干细胞的作用。在MCF-7、MDA-MB-436与ZR75-1中,表皮细胞生长因子(EGF)诱导后,Fibronectin/E-cadherin的比值增加,表明EMT的发生;联用西黄丸浸液则抑制EGF诱导升高的Fibronectin/E-cadherin的比值,表明西黄丸浸液抑制了 EGF诱导的EMT。实验结果表明,西黄丸浸液可能通过抑制EMT的发生来抑制肿瘤细胞迁移能力和肿瘤干细胞。同样采用紫杉醇处理细胞96 h后,检测细胞上清中PGE2炎症通路的细胞因子PGE2、IL-6和IL-8的水平,发现紫杉醇能诱导细胞分泌更高量的PGE2、IL-6和IL-8;而联用西黄丸则明显抑制紫杉醇诱导升高的PGE2、IL-6和IL-8的蛋白水平。并且检测IL-8的相对mRNA水平发现,紫杉醇同样上调其基因水平;而联用西黄丸浸液则抑制了这种上调。这说明紫杉醇能诱导PGE2炎症通路中细胞因子PGE2、IL-6和IL-8的水平升高,而西黄丸可以抑制紫杉醇化疗诱导升高的PGE2、IL-6和IL-8的水平。接下来检测其下游STAT3的水平发现,用0、25、50、75、150、3000μL/mL西黄丸浸液处理细胞24 h后,西黄丸浸液能抑制STAT3的磷酸化水平;浓度越大,抑制效果越明显,具有浓度相关性(P<0.01)。紫杉醇化疗诱导96 h发现,P-STAT3上调;而联用西黄丸浸液可以抑制紫杉醇诱导的P-STAT3上调。VEGF位于STAT3下游,主要参与肿瘤细胞新生血管的生成。检测VEGF的相对mRNA水平发现,西黄丸浸液能有效抑制紫杉醇诱导升高的VEGF的相对mRNA水平。结论体外实验证明,西黄丸浸液可以降低因紫杉醇化疗刺激而升高的乳腺癌干细胞表型和标志物,具有抑制乳腺癌干细胞的作用。此外,西黄丸浸液能抑制紫杉醇化疗模型诱导激活的PGE2炎症通路,降低紫杉醇诱导升高的PGE2、IL-6、IL-8等炎症因子的水平,进而抑制其下游STAT3和VEGF的激活。这提示我们,西黄丸抑制乳腺癌干细胞可能与其抑制化疗诱导激活的PGE2炎症通路有关,这可能是西黄丸延缓乳腺癌化疗耐药的分子机制之一。同时,本实验对PGE2及其下游炎症因子动态变化的研究,为深入挖掘这些炎症因子的临床意义提供了实验基础,也为扩大西黄丸的临床用药范围提供了客观依据。