4-羟基异亮氨酸（4-hydroxyisoleucine,4-HIL）是一种非蛋白质氨基酸,可促进胰岛素的分泌,用于降低胆固醇、治疗Ⅱ型糖尿病等。L-异亮氨酸（L-isoleucine,L-Ile）在L-异亮氨酸双加氧酶（L-isoleucine dioxygenase,IDO）的催化作用下可生成4-HIL,且该反应与α-酮戊二酸（α-KG）氧化脱羧生成琥珀酸的发应相耦联,通过表达并纯化来源于枯草杆菌（Bacillus subtilis）的重组IDO并分析其催化条件,从而构建IDO催化合成4-HIL的粗酶及全细胞反应体系。（1）从已有的重组菌E.coli BL21/p ET28a-ido出发,以L-Ile为底物,对采用Ni-NTA亲和层析法纯化得到的IDO进行酶学特性分析。基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol·L-1,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 s-1·mmol-1,与已报道的B.thuringiensis 2-e-2来源的双加氧酶相比,B.subtilis来源的IDO与底物的亲和力及催化效率均较高,IDO的最适温度为20℃、最适p H为7.0;在常温条件下较为稳定;在催化反应体系中Fe²⁺最适浓度为1 mmol·L-1;最适反应时间为10 h左右;当纯酶体系中L-Ile、α-KG浓度均为10²0 mmol·L-1时,4-HIL的摩尔产率相对较高。重组IDO可催化多种L-氨基酸,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的催化能力较强。（2）保持粗酶反应体系中的其它成分不变,通过单因素实验对体系中与L-Ile羟基化反应相关的因子进行优化,以确定其对羟基化反应的影响及最适添加量。其中Fe SO4·7H2O 0.1%,Vc 5 mmol·L-1,葡萄糖40⁵0 mmol·L-1,粗酶浓度15%,α-KG 30mmol·L-1,底物L-Ile 40⁵0 mmol·L-1。在0⁸ mmol·L-1范围内,异柠檬酸裂解酶抑制剂衣康酸和草酸可提高4-HIL的产量,其最适添加量均为2 mmol·L-1;异柠檬酸脱氢酶激活剂Mn²⁺可促进4-HIL的生成,Mn SO4?H2O最适添加量为2 mmol·L-1,Zn SO4?H2O的添加不利于4-HIL的生成;α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂次氯酸钠和羟基硫铵对4-HIL的产生均有一定程度的促进作用,体系中的最适添加量分别为2 mmol·L-1和4 mmol·L-1。（3）保持全细胞反应体系中的其它成分不变,通过单因素实验对体系中与L-Ile羟基化反应相关的因子进行优化,以确定其对羟基化反应的影响及最适添加量。优化结果为:Fe SO4·7H2O 0.1%,Ca Cl2 1 mmol·L-1,Vc 5 mmol·L-1,菌体浓度10%,葡萄糖30mmol·L-1,α-KG 30 mmol·L-1,底物L-Ile 40 mmol·L-1,培养条件为好氧。在0⁸ mmol·L-1范围内,异柠檬酸裂解酶抑制剂衣康酸和草酸可提高4-HIL的产量,最适添加量均为6mmol·L-1;异柠檬酸脱氢酶激活剂Mn²⁺可促进4-HIL的生成,Mn SO4?H2O最适添加量为4 mmol·L-1,Zn SO4?H2O的添加则不利于4-HIL的生成;α-酮戊二酸脱氢酶抑制剂次氯酸钠和羟基硫铵对4-HIL的产生均有一定程度的促进作用,体系中的最适添加量分别为4 mmol·L-1和6 mmol·L-1。