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禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)属于呼肠孤病毒科(Reovirdae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus),主要引起肉鸡的病毒性关节炎和腱鞘炎。近年来,我国山东、江苏、河北、福建、浙江等地的肉种鸡场和商品肉鸡场先后发生该病疫情的报道,给肉鸡养殖业带来了严重损失。本研究针对ARV野毒株LY383建立了地高辛标记的核酸探针检测方法,同时对其主要抗原蛋白σC进行了原核表达,进而建立了ARV抗体的间接ELISA检测方法,并利用纯化的重组蛋白,制备了相应的单克隆抗体,为ARV的临床检测和后续研究提供了技术支持,具体研究内容如下:根据ARV S1基因序列,设计特异性的引物,通过RT-PCR扩增得到229bp的基因片段,将纯化后的胶回收产物利用地高辛进行标记,制备核酸探针,建立地高辛标记的核酸探针检测ARV的方法。特异性试验结果表明,H9亚型禽流感病毒(H9-AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽腺病毒(FAV)、新城疫病毒(NDV)的核酸无法与探针杂交显色,只有ARV与该探针杂交结果为阳性;敏感性试验结果表明,标记探针最低检出量为50pg/μL。对临床采集的13份疑似感染病料进行检测,与RT-PCR检测结果的符合率为100%。制备的探针保存在-20°C冰箱中90d后仍可继续用于检测,稳定性较好。以上结果表明所建立的ARV地高辛标记的核酸探针检测方法具有较好的特异性、敏感性和稳定性,操作简便,可大批量检测临床样本。设计一对特异性引物,经RT-PCR反应扩增出ARVσC基因片段,克隆至pMD18-T载体,将测序鉴定正确的重组载体σC-pMD18-T和表达载体pET-32a(+)分别进行双酶切反应后,构建σC-pET-32a重组表达质粒,转入E.coli BL21(DE3)表达菌。通过优化蛋白诱导表达的条件,表达融合蛋白,经过尿素梯度洗涤法初步纯化和镍柱再次纯化后,进行SDS-PAGE电泳,确定目的蛋白的表达形式为包涵体,Western blot鉴定结果显示,表达的融合蛋白具有良好的反应性。利用表达的重组蛋白建立检测ARV抗体的间接ELISA方法:棋盘稀释法确定目的蛋白的最佳包被稀释度为1:1000;血清最佳稀释度为1:10;最佳封闭液为5%脱脂奶粉;兔抗鸡IgG-HRP酶标二抗稀释度为1:500。该方法与其他病原体之间无阳性反应,板间和板内试验确定其变异系数为4.85%至7.93%,具有较好的重复性,可应用于大规模血清学调查和流行病学监测。将纯化后的σC重组蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经过筛选和亚克隆最终获得2株能稳定分泌σC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为A1S9、B2D9,通过抗体亚类试剂盒测定所获得的单抗为IgG1亚型、轻链为κ链。ELISA效价测定结果显示,上清效价为1:100,小鼠腹水的效价为1:128000和1:256000。Western blot和IFA鉴定结果显示制备的单抗可与ARV发生特异性反应。