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研究背景及目的异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem celltransplantation,allo-HSCT)现广泛应用于恶性血液病、恶性肿瘤、某些自身免疫性疾病及某些遗传与代谢疾病等治疗。制约其临床应用的主要原因之一是供者来源困难。为了扩大供者来源,由国内北京大学人民医院原创的“在HLA单倍型相合造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)中,采用非体外去除T细胞—粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony-stimulating factor,G-CSF)动员外周血干细胞和骨髓混合移植”技术获得极大成功,能显著降低移植后移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)的发生率与致死率,其疗效相当于人类白细胞抗原(Human leucocyte antigen,HLA)相合同胞HSCT。然而,G-CSF在HLA单倍型相合HSCT中诱导的免疫耐受机理至今尚未完全阐明,且单纯动员的外周血干细胞移植并不能降低移植后GVHD的发生率和致死率,尤其是慢性移植物抗宿主病(Chronic graft-versus-host disease,cGVHD)发生。G-CSF动员外周血干细胞需要联合骨髓移植才能达到理想的免疫耐受作用。这使我们提出了动员后骨髓中是否存在诱导免疫耐受的其他因素的假设。人白细胞抗原G(Human leukocyte antigen,HLA-G)是非经典HLA-I类分子,HLA-G作为新的免疫抑制分子在妊娠免疫、肿瘤免疫逃逸及实体器官移植等方面已有广泛研究,并对其在诱导免疫耐受机理进行了初步探讨:抑制CD8+T细胞和自然杀伤(Natural killer,NK)细胞杀伤活性、抑制CD4+T细胞增殖、抑制异源性反应T细胞增殖周期、影响APC成熟和功能、诱导调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg细胞)形成、调节细胞因子分泌等。因HLA-G与免疫耐受密切相关,因此我们设想:G-CSF动员单纯外周血干细胞移植不能良好的诱导免疫耐受,而联合动员的骨髓移植则产生良好的免疫耐受是否与骨髓中富含的HLA-G这一免疫抑制分子有关?G-CSF作为细胞因子能否诱导HLA-G表达和分泌?G-CSF通过HLA-G如何调节细胞因子分泌诱导免疫耐受?本研究将针对这些问题开展。方法流式细胞术检测G-CSF动员前后外周血和骨髓中膜结合型HLA-G(Membrane-bound Human leukocyte antigen-G,mHLA-G)表达,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆及骨髓液分泌型HLA-GHLA-G(Secretory Human leukocyte antigen-G,sHLA-G)含量;检测加入G-CSF培养后的骨髓单个核细胞及外周血单个核细胞HLA-G表达及分泌情况,并检测HLA-G在骨髓各细胞亚群表达情况;建立G-CSF刺激后HLA-G稳定表达的T淋巴细胞作为进一步研究HLA-G诱导免疫耐受机理的实验细胞:①混合淋巴细胞实验探讨能抑制T细胞的异源性增殖反应;②与同种异源骨髓单个核细胞共同培养检测上清液中IFN-γ及IL-10浓度,探讨HLA-G对细胞因子分泌的影响。数据统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行处理,两组间比较采用两独立样本t检验,不同时间点mHLA-G、sHLA-G比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果G-CSF动员后mHLA-G及sHLA-G在外周血和骨髓中均显著高于未动员者(均有P＜0.05),骨髓细胞动员后组mHLA-G、sHLA-G含量也显著高于外周血动员后组(均有P＜0.05);骨髓单个核细胞及外周血单个核细胞经G-CSF刺激培养后mHLA-G及sHLA-G均较对照组高(均有P＜0.05)且存在时间差异(第1d表达增高,d3、5与d1比无显著性差异);G-CSF刺激骨髓单个核细胞,HLA-G在CD3+细胞相对较高;G-CSF刺激后的HLA-G稳定表达T淋巴细胞作为刺激细胞进行混合淋巴细胞实验测得RPI为54.3%,细胞与同种异源骨髓单个核细胞共同培养检测上清液中IFN-γ、IL-10均显著高于对照组(均有P＜0.05)。结论G-CSF动员的骨髓能更好的诱导免疫耐受可能与动员后骨髓中富含HLA-G这一免疫抑制分子有关。G-CSF可以直接上调HLA-G表达及分泌。G-CSF通过HLA-G诱导免疫耐受的机理可能为:抑制异源性T细胞增殖反应;上调骨髓移植物中IFN-γ、IL-10分泌。