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目的:肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤,在全球肿瘤相关死亡率中排第四位;在我国60岁以下的男性中排在肿瘤相关死亡率的首位。包括肝癌在内的绝大多数实体肿瘤中存在着缺氧微环境,缺氧是大多数实体瘤的特征之一,缺氧微环境的存在促进了肿瘤细胞的转移,增强了肿瘤细胞对放化疗的耐受,同时也改变了肿瘤细胞的基因表达水平。缺氧微环境下,肿瘤细胞通过上调多个基因促进多种糖酵解关键酶的表达,以增强细胞糖酵解过程,为肿瘤细胞适应低氧环境提供生存所必须的能量和物质。然而目前对于肝癌糖酵解调控分子机制的研究依然尚不明确,深入探索低氧微环境下肝癌细胞糖酵解调控的分子机制,将有助于研发新的肝癌治疗方案。Yes相关蛋白(Yes association protein,YAP)是重要的转录共激活因子,也是关键的核浆穿梭蛋白,在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中异常高表达,主要在细胞核中发挥转录调控作用。关于YAP在肿瘤能量代谢过程中的调控机制研究,已经成为肿瘤治疗领域的一个新的研究热点。细胞内增强的糖酵解状态能够通过上调糖酵解关键酶的表达促进YAP蛋白活性的表达,而YAP蛋白活性的增强又能反过来调控糖酵解关键酶的表达,进而促进肿瘤细胞糖酵解的发生。同时YAP也可以抑制肿瘤细胞糖异生过程,减少血清中葡萄糖的表达水平。然而在低氧微环境中,YAP是如何参与调控肝癌细胞糖酵解依然尚不清楚。因此本研究拟通过临床组织标本和体外细胞实验,深入探讨低氧条件下YAP参与调控肝癌细胞糖酵解的具体分子机制,为肝癌开发新的临床治疗策略提供分子水平的理论依据。研究方法:(1)1.采用real-time PCR和western blotting方法检测54例肝癌组织和癌旁组织中YAP的表达水平;2.采用免疫组化、免疫荧光和细胞核质蛋白分离方法检测YAP在肝癌组织和癌旁组织中的表达定位情况;3.采用GSEA基因富集分析方法分析肝癌低氧组织中Hippo-YAP的富集情况;4.采用real-time PCR和western blotting方法分析YAP与HIF-1α的表达相关性。(2)分别在常氧(20%O2)和低氧(1%O2)条件下培养HepG2、Huh7肝癌细胞 24 小时。1.采用 western blotting 方法检测 HIF-1α、LATS1、p-LATS1(Ser 909)、YAP、p-YAP(Ser127)蛋白的表达水平;2.采用细胞免疫荧光和细胞核质蛋白分离方法检测YAP的表达定位;3.采用real-time PCR检测YAP下游靶基因CTGF、CYR61、AREG和EDN1的表达水平;4.应用siRNA转染的方法敲低HIF-1α的表达,采用western blotting方法检测YAP、p-YAP(Ser127)蛋白表达,采用细胞免疫荧光的方法检测YAP的表达定位。5.应用葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖摄取量,应用乳酸检测试剂盒检测乳酸产生量;6.应用海马能量分析仪检测细胞外酸化率(ECAR);7.采用 real-time PCR 和 western blotting 检测 Glut1、PKM2、LDHA 和PGK1的表达水平;8.采用Transwell方法检测细胞侵袭和迁移情况。(3)应用siRNA转染的方法敲低YAP的表达,在低氧(1%O2)条件下培养24小时。1.应用葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖摄取量,应用乳酸检测试剂盒检测乳酸产生量;2.应用海马能量分析仪检测细胞外酸化率(ECAR);3.采用real-time PCR 和 western blotting 方法检测 HIF-1α 和 PKM2 的表达水平;4.采用 Transwell方法检测细胞侵袭和迁移情况。(4)1.通过 HitPredict 网站(http://hintdb.hgc.jp/htp/)预测 YAP 与 HIF-1α 蛋白相互结合;2.采用细胞免疫荧光的方法检测YAP和HIF-1α的表达定位;3.采用免疫共沉淀(Co-IP)方法检测YAP与HIF-1α蛋白的结合;4.应用细胞转染的方法敲低YAP(siRNA)或激活YAP(YAP5SA)的表达,在低氧(1%O2)条件下培养24小时,采用real-time PCR和western blotting检测HIF-1α的表达水平;5.应用放线菌素D抑制细胞内蛋白质合成,检测HIF-1α蛋白的表达变化;6.应用染色质免疫共沉淀方法检测YAP-HIF-1α与PKM2启动子结合情况;7.应用荧光素酶报告基因检测PKM2启动子区域HRE结合序列。结果:(1)1.与癌旁组织相比,YAP在肝癌组织中高表达,差异具有统计学意义;2.YAP在肝癌组织中主要在细胞核中定位表达,在癌旁组织中则主要在细胞质中表达;3.GSEA基因富集分析结果显示,低氧肝癌组织中存在着Hippo-YAP的富集,同时分析TCGA数据库369例肝癌临床样本中HIF-1αmRNA与YAP mRNA的相对表达水平,结果显示两者表达水平呈显著正相关;4.Real-time PCR和western blotting结果表明,54例新鲜肝癌组织和癌旁组织中YAP与HIF-1α的表达呈显著正相关(2)与常氧(20%O2)条件下培养相比,1.低氧(1%O2)条件下肝癌细胞中HIF-1α 蛋白的表达量显著升高,LATS1、p-LATS1(Ser909)、p-YAP(Ser127)蛋白的表达量明显减少,YAP蛋白表达量基本不变;2.细胞免疫荧光和细胞核质蛋白分离方法检测结果显示,低氧(1%O2)条件下YAP主要在肝癌细胞核中表达定位;3.低氧(1%O2)条件下YAP下游靶基因CTGF、CYR61、AREG和EDN1的表达水平明显升高;4.敲低HIF-1α的表达后,YAP、p-YAP(Ser127)蛋白表达未改变,YAP在细胞核中的表达定位未改变。5.低氧(1%O2)条件下肝癌细胞的葡萄糖摄取量和乳酸产生量均显著增加;6.低氧(1%O2)条件下细胞外酸化率显著增加;7.低氧(1%O2)条件下Glut1、PKM2、LDHA和PGK1的表达均增加,其中PKM2的表达改变最显著;8.低氧(1%O2)条件下肝癌细胞的侵袭和迁移能力显著增强。(3)低氧(1%O2)条件下,1.敲低YAP的表达显著减少肝癌细胞的葡萄糖摄取量和乳酸产生量;2.敲低YAP的表达后显著减少肝癌细胞的细胞外酸化率(ECAR);3.敲低YAP的表达显著减少PKM2 mRNA和PKM2蛋白的表达水平,显著减少HIF-1α蛋白的表达水平;4.敲低YAP的表达后显著减弱肝癌细胞的侵袭和迁移能力。(4)1.生物信息学预测YAP与HIF-1α蛋白存在相互结合;2.低氧(1%O2)条件下,YAP和HIF-1α在肝癌细胞核中表达共定位;3.低氧(1%O2)条件下,YAP与HIF-1α蛋白相互结合;4.在低氧(1%O2)条件下,沉默YAP(siRNA)或激活YAP(YAP5SA)的表达,HIF-1α mRNA的表达水平未改变,HIF-1α蛋白的表达水平相应减少和增加;5.沉默YAP(siRNA)的表达后,HIF-1α蛋白的降解速度显著增快;6.低氧(1%O2)条件下,YAP-HIF-1α与PKM2启动子中潜在的HRE结合序列(5’-ACGTG-3’)结合,上调PKM2的表达。结论:在肝癌细胞中,低氧条件下YAP在细胞核中结合并稳定HIF-1α蛋白,上调PKM2基因的表达,促进了肝癌细胞糖酵解的发生,将为未来肝癌的临床靶向治疗提供新的治疗策略和靶点支持。