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猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）是一种无囊膜的小型单链环状DNA病毒，病毒粒子为17 nm左右。PCV分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）。与PCV2相关的一系疾病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）等称PCVD。PCVD给养猪业造成的危害重大，至今疫苗免疫仍然是防控PCV2的主要手段。国内PCV2疫苗主要为灭活苗，价格偏高，且难以将猪体内已感染的PCV2彻底清除，所诱导产生抗体不能与野毒抗体相区别。因此，研发高效廉价的，所诱导产生的抗体能与野毒抗体相区分的亚单位疫苗具有重要意义。PCV2的ORF2编码233或234个氨基酸残基构成的PCV2 Cap蛋白是PCV2的唯一结构蛋白，也是主要免疫原性蛋白（Mankertz A et al., 1998），Cap蛋白已被研制成PCV2亚单位疫苗使用。本研究致力于构建能表达携带标记的PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒，所获得的标记蛋白可为PCV2亚单位疫苗的研究提供素材： 1. PCV2 GZ-RH1株ORF2生物信息学分析及Flag表位标签的引入 为了解PCV2 GZ-RH1株ORF2的分子特征和构建携带Flag表位标签的PCV2全基因克隆质粒，本研究应用生物信息学软件对PCV2 ORF2基因进行分析后，设计特异性引物，通过PCR扩增、TA克隆等技术将Flag标签引至PCV2 ORF2的末端。PCV2 ORF2遗传进化树显示，PCV2的分布时限性与地域性不明显；PCV2 GZ-RH1株基因型属于PCV2b亚型，ORF2较为保守。PCV2 GZ-RH1株的ORF2推导蛋白结果显示，ORF2编码蛋白为亲水性、混合型蛋白，潜在磷酸化位点与现有疫苗毒株差异较大，但蛋白结构与疫苗毒株相似性较高；ORF2编码氨基酸具有精氨酸富集区；PCV2 ORF2基因密码子偏好性较弱，该基因密码子偏好性主要受自然选择压力影响。密码子使用频率分析得出，选择表达系统对ORF2基因进行表达时，昆虫细胞杆状病毒表达系统（Insect cell-baculovirus expression system, IC-BEVS）较理想。经质粒PCR、双酶切鉴定、测序分析结果显示，成功将Flag标签引入至PCV2 GZ-RH1株ORF2的C端，从而构建了pMD19-T-PCV2-Flag重组质粒。本研究对PCV2 GZ-RH1株的ORF2基因及其所编码蛋白进行较深入的预测分析，为后续的研究提供理论依据；构建的pMD19-T-PCV2-Flag质粒为构建携带能表达PCV2 Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒载体提供素材。 2. 猪圆环病毒2型Cap标记蛋白的重组杆状病毒表达载体的构建 为构建能表达带有标记的PCV2 Cap蛋白的重组昆虫杆状病毒载体，通过克隆技术，分别将pMD19-T-PCV2-Flag、pMD19-T-PCV2-V5质粒上携带标签的ORF2亚克隆至转移载体pFastBacHTA，重组转移载体转化入DH10Bac感受态细胞，生成重组杆粒转染Sf-9昆虫细胞；通过透射电子显微镜观察重组杆状病毒在Sf-9昆虫细胞中的拯救，通过间接免疫荧光抗体（ IFA ）试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）、免疫印迹试验（Western-blotting）等对IC-BEVS表达的标记蛋白进行检测。结果显示，成功构建出pFastBacHTA-ORF2-V5和pFastBacHTA-ORF2-Flag重组转移载体，在DH10Bac感受态细胞中生成了重组杆粒rBacmid-Cap-V5和rBacmid-Cap-Flag；在Sf-9细胞中拯救出重组杆状病毒rAcMNPV-Cap-V5与rAcMNPV-Cap-Flag。通过IFA试验观察到细胞中的特异荧光，SDS-PAGE凝胶电泳、Western-blotting分析可见30 kDa左右目的条带，表明Cap标记蛋白在昆虫细胞Sf-9中得以表达；同时也表明所表达的标记重组蛋白能对V5抗体和Flag抗体具有良好的反应原性。本研究可为PCV2基因工程亚单位标签疫苗的研制，以及配套鉴别诊断方法的建立奠定坚实的基础。