大脑皮质发育障碍（malformations of cortical development，MCD）属于小儿常见的中枢神经系统发育异常性疾病，近年来，由于高清影像学技术的不断更新发展，MCDs的诊断率逐年升高，现已证实在小于3岁的儿童药物难治性癫痫病人中原发MCD的病人高达80%，MCD已成为小儿难治性癫痫的重要病因之一。因此，阐明MCD的病理发生机制对临床治疗MCD及预防难治性癫痫的发生具有重要意义。在已有癫痫症状发作的MCD病人中，局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia，FCD)和结节性硬化（tuberous sclerosis complexes，TSC）是最常见的两种MCD亚型[1]。虽然临床表现不尽相同，但两者在大脑病变区域具有相同的病理学特征即：①皮质层状结构和柱状结构紊乱；②病灶区出现大量与癫痫发作密切相关的异常细胞即“异构神经元”（misshapencells），这些异构神经元包括：异形神经元（dysmorphic neurons，DNs）、巨型神经元（giantneurons，GNs）、FCDIIb中的气球样细胞（balloon cells，BCs）以及TSC中的巨细胞（giantcells，GCs）。现有研究表明，MCD癫痫发作是异构神经元“电点燃”病灶临近脑区神经元后同步放电的结果，异构神经元通常被认作是MCD癫痫样放电的内在“促发器（pacemakers）”，临床资料也证明伴有异构神经元的MCD患者出现癫痫发作的几率更大。因此，阐明异构神经元的起源以及病理学发生对了解MCD的病理学发展及演变具有重要意义。病理学上，异构神经元具有“异形”和“异位”两个主要特征，异形是指异构神经元与正常神经元相比，形状异常以及轴突发育和指向的异常；异位是指异构神经元的分布的异常，如大量的异构神经元滞留于白质区造成皮质结构紊乱及畸形（无脑回，双脑回，多脑回等）。异构神经元的异形和异位均被认为是形成MCD病灶区兴奋性神经网络的重要原因。目前对于异构神经元的异形，异位病理发生的相关机制还没有明确定论，比较公认的观点认为胚胎发育期或皮质发育晚期（围产期、出生后）神经前体细胞（NPCs）向皮质迁移时发生迁移、分化、及成熟障碍，是MCD病灶中的异构神经元形成的重要因素之一，因此具有调节轴突发育以及NPCs迁移生理功能的相关分子成为研究关注的重点。其中，Nogo-A蛋白，一种氨基酸的膜蛋白，因为其特殊的双重性质（轴突生长抑制因子以及NPCs迁移调控因子）受到我们的关注。Nogo-A是内质网蛋白家族成员，广泛参与中枢神经系统的发育过程，在生理条件下，Nogo-A高表达于哺乳动物的胚胎期，出生后表达逐渐降低且主要表达于少突胶质细胞，少部分表达于神经元。Chen MS[9]在Nature发表论著，观察到Nogo-A在体内和体外都表现出强烈的抑制轴突生长的作用。随后研究发现Nogo-A主要与细胞表面受体NgR协同作用，向胞浆内转导Nogo-66细胞生长抑制信号。这一发现揭示了Nogo-A蛋白在成熟中枢神经系统病理损伤中所起的重要作用。最近的研究发现Nogo-A在胚胎期神经发育过程中对神经干细胞的辐射迁移活力具有抑制作用，应用Nogo-A基因敲除小鼠与野生鼠比较，基因敲除鼠放射迁移的神经前体细胞的活动力增强，到达较上的皮层（CP/MZ）的NPCs数量增加；同样使用抗体阻断NgR or LINGO-1，神经前体细胞的迁移活性增强；在体外试验中，体外培养的NPCs在加入一定量重组Nogo-A蛋白后，NPCs放射迁移速率减慢，移动距离缩短。此外，研究表明Nogo-A蛋白富集与神经髓鞘的郎飞结区可能影响髓鞘表面选择性离子通道的表达分布。因此，Nogo-A蛋白是一种具备在胚胎期抑制神经前体细胞迁移，在成年个体抑制再生神经元轴突形成，调节选择性离子通道分布的具有多重性质的蛋白，而过去研究对于其在SVZ区前体细胞迁移中的作用以及其可能的MCD致痫机制研究还未见研究报道。鉴于上述科学研究背景，我们提出以下科学问题：Nogo-A及其受体在MCD中的具体表达模式如何？是否表达于异构神经元？异常表达的Nogo-A参与病理发生的可能机制有哪些？为了阐明Nogo-A蛋白及其信号通路在MCD中的作用及其可能的机制，我们设计以下研究内容：1.利用半定量RT-PCR、Western blot、免疫组织化学技术观察了Nogo-A蛋白及其受体在MCD (TSC与FCD Ⅱb)临床标本中的表达分布情况；2.观测了Nogo-A蛋白下游相关信号分子（LINGO-1、P75、TROY、RhoA）的表达活化情况；3.为了调查Nogo-A对SVZ NPCs向MCD病灶区迁移的调节作用，我们建立MCD大鼠模型，利用eGFP示踪迁移的NPCs，并通过外源性添加和拮抗Nogo-A蛋白观察Nogo-A对SVZNPCs向MCD病灶区迁移的影响，初步揭示Nogo-A蛋白参与异构神经元病理发生的相关机制。其主要结果如下：一、Nogo-A蛋白及其受体在MCD中的表达分布1．本研究中，我们利用临床MCDs常见亚型（TSC和FCDIIb）的手术切除标本，从基因以及蛋白表达水平证明Nogo-A以及受体NgR在TSC皮质结节和FCDIIb皮质致痫灶中表达上调。2．利用免疫组化和免疫荧光双标法，我们发现Nogo-A以及受体NgR在TSC皮质结节和FCDIIb的皮质致痫灶中的表达定位具有明显的细胞特异性，即：都高表达于来源于SVZ区NPCs的异构神经元上。这些Nogo-A，NgR阳性的异构神经元，除了FCDIIb中的一些BCs表现为胶质细胞谱系外，大多与神经元特异性标志物共表达，表现为神经元谱系。这些结果说明，Nogo-A及其受体可能在这些SVZ NPCs源性的异构神经元的病理发生中发挥重要作用。3．与病灶组织不同，Nogo-A，NgR在邻近MCDs病灶周围结构基本正常的组织中的表达并没有明显的升高，提示MCDs癫痫发作可能不是诱导Nogo-A上调的关键因素。二、MCD病灶内Nogo-A蛋白下游信号通路的表达活化1．利用Western blot检测了Nogo-A下游信号分子，LINGO-1、P75、TORY、RhoA在TSC皮质结节和FCDIIb致痫灶中的表达情况，结果表明下游信号分子LINGO-1、TORY、RhoA在MCDs病灶区表达上调，与对照组相比有显著性差异，而P75表达无明显变化，提示在MCDs病灶区，Nogo-A下游的NgR/LINGO-1/TORY-RhoA信号通路被激活。2．进一步的免疫组化观察实验显示，LINGO-1、TORY、RhoA在不同异构神经元都有强烈表达，包括DNs、BCs、GCs.三、Nogo-A蛋白与Nav1.1，Nav1.3通道在MCD病灶区域内细胞定位的相似性分析1.与正常皮层相比，MCD组织匀浆中Nav1.1基因及蛋白表达没有明显变化；而Nav1.3mRNA及蛋白水平则表达明显上调，具有统计学差异，提示Nav1.3而不是Nav1.1可能在FCDIIb病灶的癫痫样活动中发挥重要作用。2.免疫组化结果显示，Nav1.3具有特殊的细胞定位模式，及Nav1.3的免疫反应沉积物主要定位于DNs以及GNs。这种表达方式与Nogo-A的表达定位方式相似，相关性研究表明Nogo-A表达与Nav1.3表达呈正相关，这一结果提示Nogo-A可能与Nav1.3在FCDIIb病灶区域的特征性分布密切相关。四、Nogo-A蛋白调节SVZ来源的神经前体细胞迁移的研究1．本部分研究拟通过动物模型实验，观察Nogo-A蛋白在MCD不同时期的空间时间分布情况，以及通过干预方式初步观察Nogo-A蛋白对SVZ NPCs的迁移调节作用。首先，我们建立的FCFL模型，在行为学上，具备了FCD模型动物的行为特征。形态学、神经病理学鉴结果显示：该模型的脑皮层出现了FCD典型的微脑回畸形结构。组织学观察可见原有皮层的正常结构消失，出现异常的分层结构，神经元排列紊乱，柱状极性消失，在微脑回畸形边缘可见一些神经元出现核固缩，偶见一些形态异常的巨型神经元。这些特征与以往的文献报道相符。因此建立的FCFL模型符合我们进一步实验的要求，也为后续研究提供了基础保障。2．利用腺病毒转染的eGFP作为示踪剂，我们成功地对SVZ区域的NPCs进行了在体(in vivo)示踪观察。结果显示，eGFP-FCFL模型冰冻损伤灶内可见eGFP (+)细胞形成的细胞迁移流(SFMS)。而且，eGFP (+)细胞形成的SFMS持续存在于P10到P75，及大鼠发育成熟的各个阶段。利用免疫荧光利用免疫荧光双标技术，我们对eGFP-FCFL模型SFMS中的eGFP (+)细胞进行了进一步鉴定。结果显示，SFMS中eGFP(+)不同程度地表现为PSA-NCAM、DCX以及CRMP4阳性。这一结果提示，局部皮层冰冻损伤可以激活了SVZ NPCs向病灶区迁移，微脑回畸形SFMS中的eGFP (+)细胞是由SVZ源性的NPCs迁移而来，这些细胞具有一定的迁移活性，部分仍保留干细胞特性。3．观察Nogo-A蛋白在模型组及对照组不同发育时期的皮质区域的表达情况，结果显示Nogo-A蛋白随着大鼠的发育在大脑皮质中的表达呈逐渐降低的趋势。而在P10、P20、P30三个时期，模型组相对对照组表达明显升高，且具有统计学的差异，这一结果提示在MCD的病理过程中，在一定的时期内Nogo-A的表达发生异常。进一步的免疫组化研究发现，与对照组中正常神经元Nogo-A主要表达与胞膜不同，在模型组微脑回及其微脑旁回的神经元细胞中，Nogo-A可见明显的神经元胞浆以及轴突表达，Nogo-A的免疫阳性表达明显高于对照组皮质神经元，这些结果为Nogo-A参与MCD的病理发生机制提供了形态学上的依据。4．通过在P0期采用重组Nogo-A蛋白及Nogo-A拮抗剂（NEP1-40）的干预研究，结果显示提高大脑局部微环境中Nogo-A表达的含量，迁移到皮质畸形区域中的eGFP (+)细胞减少，SMFS呈线性分布，而拮抗剂组迁移到皮质畸形区域中的eGFP (+)细胞增加，迁移分布更加弥散。这个结果提示Nogo-A蛋白对SVZ NPCs的迁移有抑制调节作用。异常表达的Nogo-A通过对NPCs迁移的异常调控可能是导致异构神经元异位分布的重要机制之一。综上所述，本研究结果表明：第一、Nogo-A蛋白及其受体NgR在MCD病人组织中表达显著上调，且在异构神经元上特征性地高表达；第二、MCD中Nogo-A下游通路中LINGO-1、TORY、RhoA信号分子被激活，有益地提示Nogo-A可能选择性地通过激活NgR/TORY/LINGO-1-RhoA（而非NgR/P75/LINGO-1）所执行的生物学效应参与MCD的病理发生；第三、在FCDIIb皮质病灶区中，选择性Nav1.3通道表达与Nogo-A呈正相关，并具有相似的定位分布，提示Nogo-A可能通过影响Nav1.3通道定位表达参与异构神经元电生理特性的调节；第四、异常表达的Nogo-A通过对NPCs迁移的调控可能是Nogo-A蛋白参与异构神经元病理发生的重要机制之一。总之，我们的研究结果提示MCD的病理发生及其致痫性与Nogo-A蛋白异常高表达所执行的生物学功能密切相关。