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目的: 研究高浓度碘化钾(potassium iodide,KI)对Fisher大鼠甲状腺细胞(Fisher rat thyroid cell line,FRTL)相对细胞活力、LDH漏出率、线粒体超氧化物生成、细胞Prx3(peroxiredoxins3)蛋白表达、活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase3)和活化型半胱天冬酶9(cleaved caspase9)及细胞凋亡的影响,探讨100μM KI对 FRTL细胞氧化损伤的发生、发展过程和机制,并用二乙基二硫氨基甲酸(diethyldithiocarbamic acid,DETC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及线粒体呼吸链复合体I或III(mitochondrial ETC complex I or complex III)抑制剂鱼藤酮(Rotenone)或抗霉素A(Antimycin A)进行干预,研究其对100μM KI导致的FRTL细胞氧化损伤的影响。 利用金属硫蛋白 I/II敲除小鼠(methallothionein I/II knockout mice,MT-I/II KO mice)建立短期碘过量的动物模型,探讨在有和没有MT-I/II的情况下,短期碘过量对小鼠脾细胞的影响,并探讨高碘对MT-I/II KO小鼠脾细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率和脾细胞线粒体超氧化物生成、Prx3蛋白表达及脏体比的影响并探讨其机制。 方法: 一、高浓度碘对FRTL细胞氧化损伤的影响 1.FRTL细胞分别用100μM KI、2 mM DETC、100μM KI+2 mM DETC、1000 unit/ml SOD、100μM KI+1000 unit/ml SOD、0.5μM Rotenone、100μM KI+0.5μM Rotenone、10μM Antimycin A、100μM KI+10μM Antimycin A处理2h,应用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测各处理因素对FRTL细胞活力的影响。 2.利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)测定试剂盒检测细胞培养液上清的LDH漏出率。 3.利用线粒体荧光探针[3,8- phenanthridinediamine,5-(6-triphenylphosphoniumhexyl)-5,6 dihydro-6-phenyl,MitoSOX]通过流式细胞术和荧光显微镜检测FRTL细胞线粒体超氧化物生成。 4.利用细胞免疫荧光染色,通过荧光显微镜检测FRTL细胞Prx3蛋白表达量的变化。 5.利用Western blot技术,检测FRTL细胞Prx3蛋白表达量的变化。 6.利用ELISA试剂盒检测FRTL细胞活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9的表达。 7.利用TUNEL试剂盒检测FRTL细胞凋亡率。 二、高碘对MT-I/II KO小鼠脾细胞氧化损伤的影响 在动物水平 6-8周龄雄性MT-I/II KO小鼠和同源非基因敲除小鼠(Wildtype mice,WT mice),随机分为NI(适碘)组、10HI(10倍高碘)组、100HI(100倍高碘)组,每组各10只,适碘组给与含碘量300μg/kg的饲料和不含KI的去离子水,进碘量为1.5μg/天;10HI组给与含碘量300μg/kg饲料和含有KI的去离子水,进碘量为15μg/天;100HI组给与含碘量300μg/kg饲料和含有 KI的去离子水,进碘量为150μg/天。喂养14天建立小鼠短期高碘模型。称取小鼠体重和脾脏重量,计算脏体比;制备脾细胞悬液,用MTT法检测脾细胞活力,LDH试剂盒检测脾细胞LDH漏出率,使用流式细胞术利用MitoSOX荧光探针检测脾细胞线粒体超氧化物生成,应用western-blot技术检测Prx3蛋白表达。 在细胞水平 选取6-8周龄健康雄性MT-I/II KO小鼠和同源非基因敲除(Wildtype,WT)小鼠,取脾组织,制备脾细胞悬液;细胞计数,调整脾细胞个数为5×107个/L,并接种于96孔板中(每孔100μL)。实验组每孔分别给予10-4、10-3、10-2 mol/L碘化钾(KI)及10-3 mol/L过氧化氢(H2O2)处理2 h;对照组不给予KI和H2O2处理。MTT法检测脾细胞活力,LDH试剂盒检测LDH漏出率,流式细胞术检测脾细胞线粒体超氧化物生成,western-blot技术检测Prx3蛋白表达。 结果: 一、高浓度碘对FRTL细胞氧化损伤的影响 1.100μM KI作用FRTL细胞2h,引起FRTL细胞氧化损伤 100μM KI处理2h使FRTL细胞活力降低(P<0.05),LDH漏出率增加(P<0.05),线粒体超氧化物生成增加(P<0.05),使FRTL细胞Prx3蛋白表达增加(P<0.05),活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9显著增加(P<0.05),TUNEL阳性细胞数目增加(P<0.05)。 2.DETC及SOD调节对高浓度碘引起的FRTL细胞氧化损伤的影响 (1)与100μM KI处理组相比,DETC使100μM KI处理2h引起的FRTL细胞活力降低更加明显(P<0.05),LDH漏出率增加更加明显(P<0.05),线粒体超氧化物生成增加更明显(P<0.05),使FRTL细胞Prx3蛋白表达增加更明显(P<0.05),活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9增加更加显著(P<0.05),TUNEL阳性细胞数目增加更明显(P<0.05); (2)与100μM KI处理组相比,SOD减轻了100μM KI处理2h引起的FRTL细胞活力降低(P<0.05),减轻了LDH漏出率的增加(P<0.05),减少了线粒体超氧化物生成增加(P<0.05),使FRTL细胞Prx3蛋白表达增加减少(P<0.05),活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9表达减少(P<0.05),TUNEL阳性细胞数目减少(P<0.05)。 3.呼吸链复合体I或III抑制剂对高浓度碘引起的FRTL细胞氧化损伤的影响 与100μM KI处理组相比,呼吸链复合体I抑制剂Rotenone及呼吸链复合体III抑制剂Antimycin A使100μM KI处理2h引起的FRTL细胞活力降低更加明显(P<0.05),LDH漏出率增加更加明显(P<0.05),线粒体超氧化物生成增加更明显(P<0.05),使FRTL细胞Prx3蛋白表达增加更明显(P<0.05),活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9增加更加显著(P<0.05),TUNEL阳性细胞数目增加更明显(P<0.05)。 二、高碘对MT-I/II KO小鼠脾细胞氧化损伤的影响 在动物水平 WT小鼠和MT-I/II KO小鼠分别与适碘组相比,100HI组脾脏脏体比显著下降(P<0.05);100HI组脾细胞活力下降(P<0.05);100HI组脾细胞LDH漏出率显著升高(P<0.05);100HI组脾细胞线粒体超氧化物生成显著增加(P<0.05);100HI组脾细胞Prx3蛋白表达增加(P<0.05)。MT-I/II KO小鼠与WT小鼠相比,10HI组及100HI组脏体比下降更明显(P<0.05),脾细胞活力下降更加显著(P<0.05),脾细胞LDH漏出率升高更加显著(P<0.05),脾细胞线粒体超氧化物生成增加更加显著(P<0.05)脾细胞Prx3蛋白表达增加更加明显(P<0.05)。 在细胞水平 MT-I/II KO和WT小鼠各组间脾细胞活力、LDH漏出率、脾细胞线粒体超氧化物生成和Prx3蛋白表达比较差异均具有统计学意义。其中与对照组比较,10-4、10-3、10-2 mol/L KI和10-3 mol/L H2O2组脾细胞活力显著下降(P均<0.05),LDH漏出率显著升高(P均<0.05),线粒体超氧化物生成明显增加(P均<0.05)。在10-4、10-3、10-2 mol/L KI和10-3 mol/L H2O2组,MT-I/II KO小鼠脾细胞活力低于WT小鼠(P均<0.05);LDH漏出率高于WT小鼠(P均<0.05);线粒体超氧化物生成高于WT小鼠(P均<0.05);Prx3蛋白表达高于WT小鼠(P均<0.05)。 结论: 一、高浓度碘对FRTL细胞氧化损伤的影响 1.100μM KI处理2h引起FRTL细胞产生氧化损伤,使细胞活力降低,LDH漏出率增加,线粒体超氧化物生成增加,Prx3蛋白表达增加,活化型半胱天冬酶3和活化型半胱天冬酶9显著增加,TUNEL阳性细胞数目增加。 2.2 mM DETC加重100μM KI对FRTL细胞的氧化损伤,DETC在高浓度碘引起的FRTL细胞损伤中起促进作用。 3.1000 unit/ml SOD在一定程度可以减轻100μM KI对FRTL细胞的氧化损伤,SOD在高浓度碘引起的FRTL细胞损伤中起保护作用。 4.0.5μM Rotenone及10μM Antimycin A在高浓度碘引起的FRTL细胞氧化损伤中起促进作用。 二、高碘对MT-I/II KO小鼠脾细胞氧化损伤的影响 1.100HI喂养14天可引起WT和MT-I/II KO小鼠脾细胞氧化损伤,脾脏脏体比降低,脾细胞活力降低,LDH漏出率升高,线粒体超氧化物生成增加,Prx3蛋白表达增高;与WT小鼠相比,MT-I/II KO小鼠脏体比降低、脾细胞活力降低、LDH漏出率升高、线粒体超氧化物生成增加、Prx3蛋白表达增高更为显著(100HI更明显),提示 MT-I/II在短期碘过量引起的脾细胞氧化损伤中具有一定抗氧化作用。 2.10-4、10-3、10-2 mol/L KI作用2h可引起WT和MT-I/II KO小鼠脾细胞活力降低,LDH漏出率增加,线粒体超氧化物生成增加,Prx3蛋白表达增加;与WT小鼠比较,MT-I/II KO小鼠脾细胞活力下降更为显著,LDH漏出率增加更加明显,线粒体超氧化物生成增多更为显著,Prx3蛋白表达增加更加明显,提示MT-I/II在高浓度碘引起的脾细胞氧化损伤中具有一定抗氧化作用。