一、研究背景及意义结直肠癌(Coloractal Cancer,CRC)是世界范围内严重影响人类健康与生活质量的常见疾病。据2018年全球185个国家关于CRC的流行病调查结果显示,2018年全年CRC在这些国家的新增发病例数达1800,977例,其中861,663例患者死亡,总死亡率约47.8%。在中国,近十年CRC的发病率和死亡率也呈进行性升高趋势,并且5年的生存率低,严重威胁着我国国民的健康和生活。由于普通肠镜检查普及性差和各项化验筛查的敏感性差,多数患者被诊断时已是中晚期。近年来,随着科技诊疗水平的提高和新型化疗药物进入临床,中晚期CRC患者的整体预后虽有较大幅度的改善,但肿瘤对各种化疗药物耐药成为降低CRC患者生存率的重要原因之一。因此,研究中晚期CRC患者化疗药物耐药的关键因子并阐明其作用机制,对CRC治疗和判断预后具有非常重要意义。近年来,随着基因工程测序技术的不断改进,人类动植物基因转录及表达的理解愈加深入,其中长链非编码RNAs(lncRNs)的生物功能探索是该领域研究的热点。过去科学界认为:动植物基因中仅有少于2%的基因能编码转录并翻译成各类蛋白质,多于98%的基因则无转录并翻译蛋白质的能力。然而,近年来的深入研究结果发现,这些非编码RNAs可通过调控各类基因表达参与人体各种疾病的发生发展,尤其是在各类肿瘤演变过程中所起到的作用更加显著。人浆细胞瘤变异体易位 1(Plasmacytoma Variant Translocation 1,PVT1)的转录产物与鼠类的PVT1基因同源,同样归为基因间lncRNAs。在二十世纪八十年代中期,PVT1基因在小鼠体内首先被检测出,在建立的浆细胞瘤小鼠模型,PVT1基因频繁的发生多样变体易位。随着科技发展,人们开始对PVT1的基因结构和主要构成部分的染色体易位进行了深入研究,并发现其特有的生物学功能。近年来,许多基础和临床研究发现PVT1在多种脏器肿瘤和细胞内有高表达,例如肺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、肝癌和膀胱癌等,其主要发挥类原癌基因作用,促进肿瘤演进。在多种肿瘤组织中,lncRNAs构建了复杂而又精密的调控体系,可在不同层次调控各类肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡。因此,lncRNAs不仅可作为相关肿瘤的诊断标志和预后指标,还可作为一个有效靶点对肿瘤进行相关治疗。近年来,多项研究表明PVT1在CRC组织和细胞中呈现出高表达水平,并且其水平的高低与血管侵袭、淋巴结转移和患者预后等密切相关。相关临床研究结果提示lncRNA PVT1表达水平可能与CRC患者的预后成负相关,并且PVT1基因又可促进CRC细胞的增殖、侵袭、转移和抑制凋亡。因此PVT1作为肿瘤演进过程中重要的调控基因,无论是在基因转录水平还是在转录后都起着显著的分子生物学功能。为了探讨PVT1基因表达在CRC患者5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)化疗药物耐药中的关键作用,我们首先通过收集临床确诊CRC患者的肿瘤组织标本,利用RT-qPCR的方法检测CRC组织中PVT1表达水平,并通过统计学探讨CRC患者化疗有效组和无效组之间临床病理学参数。其次,通过体外多种分子生物学实验研究PVT1表达在CRC细胞系中的作用,探讨PVT1表达与5-FU耐药细胞系的细胞生长及细胞凋亡等生物学行为的相关性;最后,通过检测CRC患者肿瘤组织中PVT1表达,阐明PVT1与CRC患者近远期预后的相关性。我们通过各种分子生物学实验和临床检测手段,明确PVT1在CRC患者中表达及机制,为CRC患者的早期诊断、治疗和预测预后提供新的理念。二、研究方法1、PVT1基因在CRC组织和细胞中的表达通过收集临床确诊的CRC患者肿瘤组织标本,根据术前临床评估(主要通过术前影像学与肿瘤标志物比较基于5-FU的FOLFOX方案化疗前后肿瘤组织大小及血清肿瘤标志物变化)中评估肿瘤大小、浸润范围及淋巴结转移情况确定诊断为:化疗有效组(术前基于5-FU的FOLFOX方案化疗有效)和化疗无效组(术前基于5-FU的FLOFOX方案化疗无效)。通过RT-qPCR法检测PVT1在化疗有效和无效的CRC肿瘤组织的表达水平,并详细分析化疗有效组和无效组的CRC患者的临床资料。进一步通过构建CRC相关5-FU耐药HCT-8和HCT-116细胞,检测PVT1基因在5-FU耐药组和正常组CRC细胞中的表达。2、PVT1基因干扰和过表达对5-FU耐药CRC细胞增殖、凋亡及耐药相关蛋白表达的影响(1)采用干扰与稳定基因沉默技术,干扰5-FU耐药的HCT-8和HCT-116细胞,过表达HCT-8和HCT-116细胞;(2)使用CCK-8检测CRC细胞的增殖和活动能力;(3)流式细胞仪检测细胞凋亡;(4)Western-blotting检测耐药蛋白 mTOR、P-gp、Bcl-2和MRP1 表达。3、PVT1调控Akt信号通路参与CRC 5-FU化疗耐药的初步研究(1)Western-blotting评估 HCT-8、、HCT-8/5-FU、、HCT-116 和 HCT-116/5-FU细胞内Akt以及p-Akt表达水平;(2)采用 Western-blotting 检测了 PVT1 过表达后 HCT-8和 HCT-116细胞Akt和p-Akt表达水平;(3)利用 LY294002 抑制剂作用于 HCT-8/5-FU 和 HCT-116/5-FU 细胞,Western-blotting 检测Akt和p-Akt表达。4、PVT1表达与CRC患者近远期预后的相关性通过收集临床和病理确诊的CRC患者肿瘤组织和配对相邻的癌旁组织标本以及详细的临床资料,RT-qPCR法检测CRC患者癌组织和癌旁组织中PVT1基因表达水平,分析PVT1表达与其临床特征的相关性,通过单因素方差分析和LSD事后检验分析不同组织中PVT1的表达水平,并使用Pearson χ2检验分析PVT1表达与分类变量之间的关系,通过Kaplan-Meier绘制CRC患者远期的生存曲线图并分析其意义。三、研究结果1、PVT1在化疗无效的CRC组织和5-FU耐药细胞中呈高表达(1)基于5-FU的FOLFOX化疗无效组CRC肿瘤组织中PVT1表达水平显著高于化疗有效组(P<0.001);(2)PVT1基因在HCT-8/5-FU和HCT-116/5-FU中的表达水平显著高于HCT-8和HCT-116(P<0.001)。2、PVT1基因过表达促进CRC肿瘤演进和化疗耐药(1)PVT1 基因被稳定干扰后,HCT-8/5-FU/siPVTl 和HCT-116/5-FU/siPVT1 细胞的增殖受到了明显的抑制(P<0.001),在PVT1基因过表达的HCT-8/oePVT1和HCT-116/oePVT1细胞株的生长速率显著高于对照组(P<0.001);(2)干扰PVT1表达后利用5-FU干预5-FU耐药的HCT-8和HCT-116细胞后,凋亡细胞数量明显增多(P<0.001),当过表达PVT1基因后利用5-FU干预HCT-8和HCT-116细胞后,凋亡细胞数量显著减少(PP0.001);(3)在HCT-8/oePVT1和HCT-116/oePVT1细胞,PVT1基因过表达组耐药相关蛋白mTOR、MRP1、P-gp和Bcl-2基因和蛋白表达水平均明显升高(P<0.001)。3、PVT1通过上调Akt信号通路参与CRC 5-FU化疗耐药(1)HCT-8/5-FU和HCT-116/5-FU细胞内的Akt表达水平与HCT-8和HCT-116细胞无显著差异,然而HCT-8/5-FU和HCT-116/5-FU细胞中P-Akt表达却明显高于HCT-8和HCT-116细胞;(2)HCT-8和HCT-116细胞PVT1过表达后P-Akt表达水平显著上调;(3)Akt和p-Akt在HCT-8/5-FU和HCT-116/5-FU细胞中的表达显著升高。虽然在LY294002处理后Akt蛋白无明显变化,但是P-Akt蛋白明显下调(P<0.001),PVT1基因表达无明显变化。4、PVT1表达与CRC患者近远期预后呈负相关(1)PVT1在CRC肿瘤组织中的表达水平显著高于配对癌旁组织(P<0.001),并且PVT1表达与性别,年龄和肿瘤位置无关。然而,PVT1表达水平与肿瘤分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移显着相关(P<0.001);(2)Kaplan-Meier分析显示,无论处于早期还是晚期的CRC患者PVT1高表达(>6.75)的CRC患者的DFS(Log-rank检验P<0.001)和OS(Log-rank检验P<0.001)均明显低于PVT1低表达组(<6.75)。四、结论1、CRC肿瘤组织中PVT1呈高表达并且可能参与CRC化疗药物耐药的相关分子机制,随着对PVT1基因的深入研究,将来其可能成为CRC对化疗耐药评估和治疗以及判断预后的重要靶向指标;2、PVT1在5-FU耐药的CRC细胞中发挥促进细胞耐药的作用,干扰PVT1可抑制5-FU耐药的CRC的增殖能力并促进细胞凋亡,而过表达PVT1后,CRC细胞增殖能力明显升高并且细胞凋亡明显减少;3、PVT1可以促进CRC肿瘤演进并诱导肿瘤对5-FU化疗耐药,通过P13K/Akt信号通路的激活上调mTOR是诱导5-FU CRC耐药的重要机制;4、PVT1高表达有助于预测CRC根治性切除后的早期复发或转移,因此肿瘤组织中PVT1的水平可用于CRC患者的个体化治疗选择,进而提高患者近远期存活时间。