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研究背景Rac3是一种多功能的小GTP酶蛋白，可以调节细胞的粘附、迁移和分化。Rac3蛋白被认为是乳腺癌的致癌基因之一，然而该蛋白在食道癌中的表达以及其稳定性的调节方式尚未被研究。F-box蛋白是泛素蛋白酶水解系统中泛素连接Skp1-Cullin-1-F-box（SCF）E3的重要亚单位，参与蛋白质的泛素化和蛋白酶降解。前期研究中，我们发现F-box蛋白家族中的SCFFBXL19作用于Rho-GTP酶Rac1和RhoA，介导其泛素化和降解。本论文研究中，将探讨FBXL19调节Rac3的泛素化和稳定性。转化生长因子β1（TGFβ1）与食道癌的预后不良密切相关，它可以降低多种上皮源性肿瘤细胞中钙黏连蛋白（E-cadherin）的表达，进而导致肿瘤细胞的转移。本研究中，我们将探讨在食道癌细胞中，FBXL19通过介导Rac3蛋白的降解和泛素化进而抑制TGFβ1诱导的食道癌细胞钙黏连蛋白下调。实验方法本研究采用免疫印迹法和免疫共沉淀法测定F-box介导Rac3蛋白的稳定性；采用免疫印迹法和免疫染色法探讨转化生长因子β1（TGFβ1）介导食道癌细胞（OE19和OE33）中钙黏连蛋白（E-cadherin）的下调。实验结果1. FBXL19降低Rac3蛋白的表达量。（1）构建了FBXL19质粒（FBXL19-V5，FBXL19-HA），转染人胚肾细胞（HEK293），均可以导致HEK293细胞内源性Rac3蛋白表达下降；（2）检测不同细胞系中Rac3蛋白的表达量，食道癌细胞系（OE19）、人胚肾细胞系（HEK293）中Rac3蛋白高表达，非小细胞肺癌细胞系（A549）中Rac3蛋白低表达，鼠肺泡上皮细胞（MLE12）中Rac3蛋白未见表达；（3）构建Rac3质粒（Rac3-V5），将其与FBXL19质粒共同转染MLE12细胞，结果表明FBXL19降低Rac3蛋白的表达呈剂量依赖性；（4）RT-PCR证实在蛋白水平上FBXL19调节Rac3的稳定性，而非mRNA水平。2. FBXL19介导Rac3降解位于蛋白酶体系统。（1）饥饿状态可以导致Rac3蛋白呈时间依赖性降解，蛋白酶体抑制剂（MG-132）可以减少饥饿状态下Rac3蛋白的降解；（2）蛋白酶体抑制剂（MG-132）可以减少FBXL19介导的Rac3蛋白的降解，证实FBXL19介导Rac3降解位于蛋白酶体系统。3. Rac3蛋白赖氨酸166位点是FBXL19介导Rac3泛素化的靶位点。4. Rac3蛋白与FBXL19相互作用位于FBXL19的羧基端（COOH）。5. Rac3蛋白调节转化生长因子β1（TGFβ1）介导的钙黏连蛋白（E-cadherin）下调。（3）TGFβ1介导食道癌细胞系（OE19和OE33）中E-cadherin下调；（4）构建Rac3失活质粒（Rac3N17-V5）和敲除质粒（shRac3），转染食道癌细胞均可抑制TGFβ1介导的E-cadherin下调；（5）食道癌细胞中转染Rac3增加Snail的表达。6. FBXL19调节TGFβ1介导的E-cadherin下调。（1）FBXL19介导食道癌细胞系（OE19和OE33）内源性Rac3蛋白泛素化和降解；（2）FBXL19质粒转染食道癌细胞，阻抑肿瘤细胞TGFβ1介导的E-cadherin下调。结论1.发现并确认了FBXL19与Rac3蛋白间存在相互作用，FBXL19介导Rac3蛋白泛素化和降解；确定了FBXL19与Rac3的赖氨酸166位点结合，Rac3蛋白与FBXL19的COOH末端结合。2. Rac3蛋白是调节TGFβ1介导肿瘤细胞钙黏连蛋白下调的重要蛋白。3. FBXL19通过介导食道癌细胞Rac3蛋白的泛素化和降解，进而抑制肿瘤细胞TGFβ1介导的钙黏连蛋白（E-cadherin）下调。