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研究背景与目的DNA修复酶类在维持细胞基因组稳定以及生物遗传稳定中发挥的重要的作用,DNA修复系统缺陷或异常与肿瘤发生的关系也受到了人们的关注,已经成为癌症病因学研究的一个热点。DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)是参与DNA修复的主要聚合酶之一,主要参与碱基切除修复(base exicisionrepair,BER)以及跨损伤修复,对受损或突变基因起修复作用。各种内源性或外源性的有害因素造成的polβ基因结构或表达的改变,都有可能最终促使肿瘤的发生和发展。研究表明,polβ在细胞中的过量表达会影响染色体的稳定性,从而参与了肿瘤的发生发展。近年研究结果显示,食管癌组织中也存在着polβ基因mRNA的高表达,且发生于癌变早期。提示polβ基因的过表达可能与食管癌的发生发展有关。通常基因的表达可受其启动子核心区域的调控。基因启动子核心区域碱基发生变异可能会影响其启动子的活性,从而引起其基因表达产物的活性和含量的改变。高表达是否与polβ基因启动子区的异常调控有关尚未见文献报道。因此,本课题拟构建含人野生型和突变型polβ基因启动子的萤光素酶表达载体,比较二者在细胞中萤光素酶表达的活性,探讨polβ基因启动子核心区域碱基突变对其基因表达的调控,为更加深入研究polβ基因启动子在食管癌发生发展中的作用和靶向基因治疗提供依据。材料与方法1.标本来源:食管正常粘膜及食管癌组织标本来自林州市肿瘤医院,经病理检查证实为鳞状上皮细胞浸润癌,术前患者未接受任何化疗或放疗。2.扩增人polβ基因启动子区域DNA片段和突变的筛选:参照polβ基因启动子序列参考文献,设计扩增DNA polβ基因启动子引物,用PCR技术扩增出人类野生型和突变型polβ基因核心启动子片段,连接载体pGEM-T Easy并转化感受态细菌DH-5α,通过α互补和采用通用引物T7/SP6行PCR以鉴定重组子pGEM-T-polβ/promoter目的片段是否转入,正反双向测序后,采用DNASIS、OMIGA软件将测序结果与GenBank查到DNA polβ启动子序列进行同源性比较,分析确定野生型polβ启动子序列和突变型polβ启动子的突变位点。3.含人polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体的构建及鉴定:将提取测序正确的重组T载体(pGEM-T-poβ/promoter)质粒和pGL3-neo-enhancer萤光素酶报告载体,分别用Xho1Ⅰ和HindⅢ双酶切,回收纯化的双粘polβ启动子目的片段亚克隆至双粘线性pGL3-neo-enhancer萤光素酶报告载体,得到的重组质粒pGL3-neo-polβ/promoter经Xho1Ⅰ和HindⅢ双酶切和PCR鉴定后,正反双向测序以鉴定构建的含人野生型和突变型polβ基因启动子萤光素酶报告基因表达载体的正确性,并确认突变存在位点仍然正确,没有发现其它差异的存在。即构建成含人野生型和突变型polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体(pGL3(W/M)polβ/promoter)。4.细胞培养及质粒转染:细胞分为4组:(1)空白组:未转染任何质粒的Eca9706细胞;(2)对照组:转染pGL3-neo-enhancer空载体;(3)野生组:转染含人野生型polβ基因启动子序列的萤光素酶报告基因表达载体pGL3Wpolβ/promoter;(4)突变组:转染含人—37位点C→A突变的polβ启动子序列萤光素酶报告基因表达载体pGL3Mpolβ/promoter。用脂质体Lipofectamine2000分别将(2)、(3)和(4)组转染Eca9706细胞,G418筛选阳性细胞克隆。每组至少重复实验3次。5.萤光素酶活性检测:采用萤光素酶萤光检测仪作各组萤光素酶活性测定,将各组的测得数值取平均值。6.统计学处理:萤光素酶活性检测数据分析处理用(?)±s表示,用SPSS 14.0统计软件行单因素方差分析,以P＜0.01为差异有显著性。结果1.PCR扩增含人polβ启动子区域的DNA片段和突变的筛选:以提取的人基因组DNA为模板,经PCR扩增获得polβ基因启动子序列,电泳可见在392bp处有一条带,与该片段的理论值一致,正反双向测序PCR扩增产物并进行同源性比较和分析,确定polβ基因启动子序列与GenBank和文献报道一致的正常序列为野生型,含—37位C→A位点突变的为突变型。2.野生型和突变型pGL3(W/M)polβ/promoter重组质粒的构建和鉴定:将野生的和存在突变的polβ基因启动子序列插入萤光素酶报告载体的多克隆位点行PCR扩增及XhoⅠ和HindⅢ双酶切筛选阳性克隆,其产物均在392bp处可见电泳条带,与该片段的理论值一致。DNh正反双向测序鉴定插入的野生型序列正常,突变型的突变位点正确不变,表明pGL3Wpolβ/promoter和pGL3Mpolβ/promoter表达载体构建成功。3.萤光素酶活性分析:空白组(值为400)、对照组、野生组和突变组之间比较,差异均有统计学意义。含—37位点C→A突变的突变型pGL3Mpolβ/promoter萤光素酶活性(7882559±201824.9)显著高于野生型pGL3Wpolβ/promoter(1112976±82900.2),P＜0.001。上述野生组和突变组分别与对照组(2743.50±227.3)比较,差异均有显著性,P＜0.001。结论1.成功构建含人野生型和突变型DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3(W/M)polβ/promoter。2.pGL3(W/M)polβ/promoter中polβ启动子对萤光素酶基因表达具有较强的启动活性,且polβ启动子区—37位C→A碱基突变可显著增强萤光素酶的表达。这为更加深入研究polβ基因启动子在食管癌发生发展中的作用和靶向基因治疗奠定了基础。