杜氏肌营养不良症(简称DMD)是一种以X连锁隐性遗传为主要遗传方式的进行性肌无力和肌萎缩疾病，发病率为1/3500活产男婴，其中约1/3为新生突变。 目前较一致的观点是该病由抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)基因突变引起。抗肌萎缩蛋白基因全长约2600kb，定位于Xp21，是目前发现的最大的人类基因，约占X染色体的2﹪，全基因组的0.05﹪。含79个外显子，DMD cDNA的长度为14kb，编码分子量427kd的蛋白。如此庞大的基因非常容易发生基因重排和重组。目前发现的基因突变存在多种类型，其中基因缺失占65﹪，基因重复占5﹪，点突变、小缺失及插入占30﹪。且突变的发生在整个基因非均匀分布，存在两个突变热区，即基因的5’端及Exon44-53之间。目前对该病尚无有效的治疗方法。 DMD主要遵循X连锁隐性遗传方式，女性携带者有50﹪的机会遗传给后代，遗传该突变基因的男性后代则成为患者，女性后代则是携带者。胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)技术为DMD女性携带者生育健康后代提供了新的选择，与既往常规的产前诊断不同，PGD技术可避免因患病胎儿而需终止妊娠。PGD是建立在体外受精与胚胎移植(In vitro fertilization andembryo transfer,IVF-ET)的基础之上，在6-8细胞阶段的胚胎活检1-2个细胞用于遗传学检测，移植基因经检测证实没有疾病的胚胎。但由于Dystrophin基因庞大、突变种类多、基因内重组和新生突变发生率高，该疾病的胚胎植入前遗传学诊断还面临一定的困难，到目前为止还没有一个统一的方案。采用全基因组扩增(Whole genome amplification，WGA)作为胚胎植入前遗传学诊断的第一步，增加起始模板量，然后再检测多个基因位点，可以大大增加单细胞分析的准确性和可靠性。 目前已有多种WGA方法，如引物延伸预扩增(Primer extensionpreamplification，PEP)和简并寡核苷酸引物PCR(Degenerated oligonucleotideprimed PCR，DOP-PCR)。由于非特异性扩增产物、对整个基因组覆盖不全、DNA产物片段长度短等限制其在PGD中的应用。多重置换扩增(Multiple displacementamplification，MDA)是1998年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出，该法不以PCR为基础。这种恒温扩增的方法依赖于链置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，该酶强大的向前延伸活性和高保真度使得通过MDA可从极少量的DNA样本获取大量高质量的DNA，是到目前为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的WGA方法。本实验研究的目的是探索MDA在胚胎植入前遗传学诊断中的应用，通过使用全基因组扩增的方法，克服胚胎植入前遗传学诊断中单细胞DNA量极少的瓶颈，解决单细胞模板量有限限制全面准确诊断的问题，建立DMD的胚胎植入前遗传学诊断方案，使该方案适用于各种基因突变类型的DMD女性携带者。 第一部分单细胞MDA结合单重荧光PCR方案评估。 目的：本研究针对单细胞MDA产物应用单重荧光PCR检测常见Dystrophin基因的缺失位点，选用多个基因内部的多态性位点行单体型分析，并同时行性别诊断，评估该方案在DMD胚胎植入前遗传学诊断中的可行性，建立适用于各种基因突变类型的DMD女性携带者的胚胎植入前遗传学诊断方案。 材料： 1.2005年10月至2006年12月于我院生殖中心就诊拟行PGD治疗的4个家系，均有DMD家族史和明确的基因检测结果，为基因缺失型突变或重复型突变。 2.本院生殖医学中心取卵后第三天正常受精的废弃胚胎。 方法： 1.外周血DNA抽提2.家系分析3.单个细胞制备4.单细胞MDA扩增5.MDA产物DNA总量测定6.MDA产物纯化7.在MDA产物应用单重荧光PCR检测17个基因位点(包括6个常见的缺失外显子，10个DMD基因内部的多态性位点，1个性别位点)。 结果： 1.家系来源的80个单个淋巴细胞(每例女性携带者各20个)及11个废胚来源的40个单个卵裂球进行MDA扩增，MDA扩增单个淋巴细胞的成功率为97.5﹪(468/480)，扩增单个卵裂球的成功率为94.1﹪(640/680)。 2.将女性携带者来源的单个淋巴细胞MDA产物的PCR结果与其外周血结果比较，平均PCR扩增失败率为2.5﹪(12/480，变化范围0-5.0﹪)，平均ADO率为12.0﹪(56/468，变化范围5.0-20.5﹪)，两者各位点PCR扩增产物的片段大小一致。单个卵裂球MDA扩增产物进行17个位点的检测，其中6个外显子位点均有扩增信号，各位点平均扩增失败率为5.9﹪(40/680，变化范围0-15.0﹪)。同一个胚胎来源的不同卵裂球的扩增结果进行比较，确定杂合位点，计算平均ADO率为27.4﹪(37/135，变化范围0-37.5﹪)。 第二部分 DMD女性携带者胚胎植入前遗传学诊断。 目的：本研究部分基于前一部分研究结果，利用已建立的单细胞MDA结合单重荧光PCR的方案，对两例Dystrophin基因重复突变和缺失突变的女性携带者进行了PGD，以期获得Dystrophin基因正常的胚胎，使出生的婴儿真正健康。 材料： 两对夫妇均有DMD家族史，有将DMD遗传给后代的风险，前来我院生殖中心要求采用PGD技术生育健康后代，突变类型分别为外显子3-11重复和外显子47-50缺失。 方法： 1.控制性超排卵2.体外受精和胚胎培养3.胚胎活检4.单细胞MDA5.单重荧光PCR检测6.移植基因检测正常胚胎7.再次分析未移植胚胎。 结果： 1.病例1：超排后获取卵子19个，10个正常受精，取卵后第3天活检并分析6个胚胎。单细胞MDA产物进行位点STRMP、STR44、STR49及性别位点AMEL，的检测。结果显示2次ADO，分别在4号胚胎来源的卵裂球扩增位点STR49和6号胚胎来源的卵裂球扩增性别位点时发生。检测到两次扩增失败，位点STRMP和STR49各1次，且均发生在同一个卵裂球，该卵裂球取自6号胚胎。两个男胚遗传其母亲正常的Dystrophin单体，诊断为正常胚胎；两个男胚及两个女胚遗传其母亲基因重复的Dystrophin单体，分别诊断为患病胚胎及携带者胚胎。取卵后第4天向宫腔移植一个Dystrophin基因检测正常的胚胎，未孕。 2.病例2：超排后获取卵子14个，其中7个MII卵子行单精子卵胞浆内显微注射，7个正常受精，取卵后第3天共活检并分析6个胚胎。位点STR2、STR4-9、STR79GT2、STR3+33、EXON48及性别位点.AMEL用于遗传分析。位点STR2和STR3+33分别发生1次ADO，STR49和性别位点分别发生2次ADO，6次ADO中3次来源于取自3号胚胎的同一个卵裂球。直接检测突变区域内EXON48的结果与单体分析结果一致。两个男胚和两个女胚遗传其母亲正常的Dystrophin单体，诊断为正常胚胎；两个男胚携带有母亲基因缺失的Dystrophin单体，诊断为患病的胚胎。取卵后第4天向宫腔移植3个基因检测正常的胚胎，获得一例宫内单胎妊娠。于孕19<+>周取羊水细胞行产前诊断，证实为。DMD非携带者女胎。现孕21<+>周，胎儿发育良好。 两例临床病例的所有阴性对照PCR产物均未检测到阳性扩增信号。未移植胚胎均采用同种方法重新检测，结果与单个卵裂球诊断结果一致。 结论： 1.本研究在国内首次应用MDA于PGD技术中，获得一例临床单胎妊娠，该例妊娠亦是在单细胞水平通过全基因组扩增后对DMD携带者进行胚胎植入前遗传学诊断的首例成功妊娠报道。 2.单细胞MDA结合基因突变检测、单体型分析及性别诊断的方法，可以有效地应用于DMD的临床PGD，适用于大多数DMD女携带者，可以在鉴别正常男胚的同时分辨携带者和非携带者女胚，降低因基因重组引起的误诊风险及有效监测外源性DNA污染。