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胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着人类健康,在我国具有较高的发病率和致死率。近年来,分子遗传学研究证明胃癌是异型性极强的恶性肿瘤,胃癌的发生发展是多步骤、多阶段、多因素参与的过程,抑癌基因的功能失活或降低、原癌基因的异常激活、基因表达调控的异常,均在肿瘤的发生和演进中发挥着重要作用。
生长抑制因子(Inhibitor of Growth,ING)包括5个家族成员。其中,ING5因具有抑制细胞生长并以p53蛋白依赖方式诱导细胞凋亡的生物学作用,被认为是一种抑癌基因。因此,我们探讨1NG5基因在胃癌细胞中的分子生物学功能及在胃癌组织中的表达及其临床意义,了解ING5在胃癌发生和演进过程中的作用,进而促进对胃癌的诊断和治疗。
材料与方法:
1、培养胃癌细胞,利用RT-PCR和实时PCR检测各种细胞系中的ING5 mRNA含量,Western Blot实验检测各种胃癌细胞中ING5蛋白表达水平。
2、构建pEGFP-N1-ING5真核表达载体,将pEGFP-N1-ING5质粒稳定转染入ING5表达相对较低的胃癌细胞SGC-7901中,挑取细胞单克隆并扩大培养,利用RT-PCR、实时PCR、免疫荧光染色、Western blot确定转染效果。
3、应用CCK-8(cell counting kit-8)检测转染pEGFP-N1-ING5质粒对胃癌细胞SGC-7901生长增殖情况的影响;应用流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)检测转染pEGFP-N1-ING5质粒后胃癌细胞SGC-7901的细胞周期变化、细胞凋亡情况及线粒体膜电位的变化情况;应用Cldu/Idu双重标记法检测pEGFP-N1-ING5质粒转染后胃癌细胞SGC-7901的复制时相变化情况;应用transwell实验检测pEGFP-N1-ING5质粒转染后对胃癌细胞SGC-7901的迁移和侵袭能力的影响;应用荧光染料标记的鬼笔环肽与细胞骨架肌动蛋白F-actin结合,进行细胞免疫荧光染色,运用激光共聚焦显微镜检测pEGFP-N1-ING5质粒转染后胃癌细胞SGC-7901细胞骨架形成的变化情况。
4、应用Western-blot检测36例胃癌新鲜标本中ING5的蛋白表达水平。
结果:
1、胃癌细胞系中ING5表达水平
ING5 mRNA和蛋白在GES-1、AGS、BGC-823、GT-3TKB、HGC-27、KATO-(III)、MGC-803、MKN28、MKN45、SCH、SGC-7901和STKM-2细胞中均有表达,但表达的程度不一。
2、转染pEGFP-N1-ING5质粒后对胃癌细胞SGC-7901生物学功能的影响
同转染pEGFP-N1空载体的胃癌细胞SGC-7901相比,转染pEGFP-N1-ING5质粒后,ING5过表达胃癌细胞SGC-7901各克隆的细胞增殖能力均有降低趋势(P<0.05),G1期比例增加,G2期比例下降(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05),线粒体膜电位检测提示细胞线粒体受损(P<0.05),细胞的迁移和侵袭能力下降(P<0.05),细胞骨架形成减少。
3、胃癌组织中ING5表达水平
与癌旁组织相比,ING5在胃癌组织中蛋白表达水平增加。
结论:
1、不同胃癌细胞系中ING5的mRNA含量和蛋白表达水平均不同。
2、pEGFP-N1-ING5真核表达质粒转染对胃癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡,抑制细胞骨架肌动蛋白组装,使细胞的迁移和侵袭能力下降的作用。
3、胃癌组织中ING5蛋白表达水平高于癌旁组织。