CD154是一种分子量为39kD的Ⅱ型跨膜糖蛋白，其基因定位于Xq26.3-Xq27.1，属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族，主要表达在活化的CD4~+T细胞和肥大细胞表面。越来越多的研究表明，CD40／CD154在特异性免疫应答中发挥重要的作用，通过CD40／CD154途径：(1)促使抗原递呈细胞的有效活化，进而介导其成熟、分化，启动免疫应答的产生；(2)活化T淋巴细胞，介导细胞免疫应答，参与记忆性T淋巴细胞的形成；(3)促使B细胞的活化、增殖、分化，分泌Ig及类别转换，对生发中心和记忆性B细胞的形成及维持起重要作用；(4)促进免疫活性细胞分泌多种细胞因子(IL-1、IL-8、IL-12、TNF-α等)，参与免疫应答的调节。 业有报道，运用抗CD154单克隆抗体阻断CD40／CD154途径，能有效地抑制特异性免疫应答，减少特异性抗体和CTL的产生，在自身免疫、移植排斥、炎症等病理免疫反应中发挥重要作用。同时，在皮肤、心脏、肾脏等小鼠移植模型中，运用抗CD154单克隆抗体能显著延长移植物的存活期，为移植排斥的防止和移植耐受的诱导提供了新方法。该单抗在基础及临床免疫学中的应用前景已受到广泛关注。 但是，鼠源性单抗作为异源蛋白，容易引起人体的人抗鼠反应(HAMA)，且抗体分子量大，在体内很难快速到达靶器官，从而限制了其临床应用，随着基因工程技术的发展，基因工程抗体为解决以上问题提供了一条有效途径。人-鼠嵌合抗体Fab片段的稳定性好，分子量不到完整抗体的1／3，使其比完整抗体更易接近靶组织。 本研究利用本实验室特有的抗人CD154单克隆抗体4F1，运用RT-PCR技术，从4F1杂交瘤细胞中克隆出抗人CD154单抗的可变区基因，并与人免疫球蛋白IgG1的恒定区基因重组成抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab融合基因，构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab，利用大肠杆菌表达简单，高效，成本低廉的特点，对重组抗体进行原核表达。实验表明联合应用各种表达优化条件，包括降低温度，减少IPTG浓度，延长诱导时间可获得可溶性蛋白表达，且蛋白表达动力学分析表明：在0.05mmol／L抗人CD巧4人一鼠嵌合抗体Fab片段的制备及其结合活性的研究摘要IPTG，1%蔗糖，18℃，诱导16h可获得可溶性蛋白表达。以羊抗人IgG(H+L)多抗为一抗，兔抗羊IgG为二抗，Western一blot检测，结果显示两条特异性条带，分子量大小约为25kD、27kD，与重、轻链蛋白理论值基本一致，且目的条带深浅一致，说明重轻链表达基本平衡，进而表明构建的共表达载体在原核细胞中得到了较好的表达。为了研究其活性和抗原结合能力，用竞争抑制实验检测Fab结合的特异性，选取高表达人CD154的CD154一L929转基因细胞(CD154一TC)与reFab反应，竞争性抑制鼠单抗4FI与CD154一TC的结合，阳性对照为CD154-TC加4FI，阴性对照只加荧光二抗。FACS结果显示，rcFab能部分竞争性抑制4FI与CD154L一TC的结合，说明rcFab能识别结合4FI的抗原位点，与CD 1 54一TC能特异性结合，部分抑制鼠源亲本抗体的结合。但是，尽管使用较大量的rcFab，考虑到重组嵌合抗体抗原结合力较天然抗体大为降低，且由于rcFab为单价，而4FI为二价，故人源化嵌合Fab抗体的亲和力较鼠源单抗有所降低，不能完全将其阻断。 总之，本实验成功克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4FI)单克隆抗体的轻链、重链可变区基因及人免疫球蛋白IgGI恒定区基因，并且拼接完成了完整的嵌合重链和嵌合轻链基因，成功构建pTXBI一Fab共表达载体，在大肠杆菌中实现可溶性表达，为抗体的分离纯化带来了便捷，同时也为本所其它鼠源性单抗的人源化嵌合Fab小分子抗体的制备奠定了技术基础。表达产物在大肠杆菌质周腔中能形成正确的空间折叠，装配成具有生物学活性的小分子抗体片段，为该分子的进一步研究和临床应用奠定了基础。