[研究背景]Burkitt淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)是一种高侵袭性,快速生长的成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤,是增殖扩散能力最强的人类肿瘤之一。目前常用的治疗方案常有放化疗、手术治疗、单克隆抗体CD20、骨髓移植治疗等方法。由于其对化疗敏感,儿童及耐受能力强的成人患者主要采用短疗程强烈化疗,但化疗毒副作用大,年老体弱、合并HIV患者难以耐受高强度化疗,难以从大剂量化疗中获益。因此,寻找一种新的药物或者新的治疗手段,既能特异杀灭肿瘤细胞,同时提高肿瘤细胞被机体免疫系统识别杀伤的敏感性,并能对机体的影响减到最小,将是研究的方向。去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)是斑蝥素去甲基化人工合成的衍生物,具有跟斑蝥素类似的药用价值,包括抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗纤维化等,但NCTD减弱了斑蝥素的强烈毒性和消除了其对泌尿系统的刺激性,保留了其抗癌和升高白细胞等的作用,是天然的丝／苏氨酸磷酸酶PP1及PP2A抑制剂。目前研究显示NCTD能抑制多种肿瘤细胞株的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡和产生细胞周期阻滞作用。 NCTD在体内抑制肿瘤细胞的同时,不降低外周血中的白细胞数量,而且对机体没有明显的骨髓抑制作用,使得其在对抗恶性肿瘤中,体现了特有的优势。但有关NCTD对Burkitt淋巴瘤Raji细胞株的作用尚未见相关报导,因此,我们拟探讨NCTD对Raji细胞株生物学特性的影响,为研究NCTD对抗恶性侵袭性淋巴瘤提供实验室基础。目前单纯细胞治疗在大多数肿瘤患者中未取得如体外实验般高的杀伤效应,其主要原因有肿瘤细胞逃避免疫细胞杀伤,体内产生免疫耐受,肿瘤细胞与免疫杀伤细胞之前存在免疫编辑,使免疫杀伤细胞丧失本来应有的功能。有研究进一步发现Burkitt淋巴瘤Raji细胞株能抵抗同种异体NK (natural kill,NK)细胞的杀伤,原因主要是肿瘤细胞表面高表达HLA-I类分子,极低表免疫激活物(immunoactivators) NKG2D配体MICA/B和ULBP1-3有关。这些配体在正常的细胞不表达或低表达,可应激性表达在一些肿瘤细胞或病原体感染的细胞的表面。活化性受体NKG2D与其配体结合产生的信号可直接激活NK细胞发生抗肿瘤效应,并作为协同刺激信号促进α β T细胞和γ δ T细胞的活化并增强其杀伤效应。因此,可通过增强NKG2D及其配体的相互作用,促使肿瘤细胞被杀伤。不同的细胞因子能促进NK细胞增殖,提高活化性受体NKG2D的表达,而NCTD是否能诱导Raji细胞增表达免疫激活物,激发机体免疫细胞对其的杀伤呢?将是本实验研究的重点。本实验从NCTD对Raji细胞株生物学特性的影响以及NCTD是否能调节Raji细胞被免疫杀伤细胞杀伤的敏感性及其初步机制探讨这2个方面进行研究,从而为NCTD对抗恶性侵袭性Burkitt淋巴瘤提供体外实验研究,了解NCTD是否能增强Raji细胞被杀伤的活性,从而探究提高过继细胞免疫治疗疗效的方法,为新的免疫治疗方案提供新的思路。第一部分去甲斑蝥素对Burkitt淋巴瘤Raji细胞株生物学特性的影响[目的]对比研究NCTD对Raji细胞和人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)的增殖抑制作用,探讨NCTD对Raji细胞的集落形成能力以及细胞周期的影响。[方法]通过台盼蓝拒染法观察不同浓度的NCTD (0.15265、0.3125、0.625、1.25、2.5ug/ml)对Raji细胞及PBMC的增殖抑制情况；甲基纤维素半固体培养基集落形成法观察的NCTD (0.0.25.0.5、lug/ml)预处理48小时组和直接作用组对Raji细胞集落形成能力和自我更新能力的影；流响式细胞仪(Flow cytometry, FCM)检测NCTD (0.5ug/ml)作用48小时后对Raji细胞周期变化的影响。应用SPSS13.0软件进行数据分析,本实验数据资料以均数±标准差(x±s)表示,NCTD对Raji细胞及PBMC的增殖抑制实验和体外集落克隆形成实验使用析因设计资料的方差分析。NCTD对Raji细胞的细胞周期影响采用独立样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]在浓度为0.15-2.5ug/ml范围内NCTD抑制Raji细胞增殖,具有剂量时间依赖性,其24小时、48小时、72小时的IC50值分别为：0.88ug/ml0.47ug/ml、0.28ug/ml在24h各浓度下Raji细胞与PBMC比较差异具有统计学意义(F=1005.664,P=0.000)。且各浓度NCTD对PBMC既无增殖亦无毒性作用,各浓度间比较差异无统计学意义(F=0.866,P=0.517)。NCTD (0、0.25、0.5、 lug/ml)直接作用组和预处理48小时组数据均显示,NCTD显著抑制Raji细胞的集落形成能力。随着药物浓度增加,细胞克隆数骤减(F=530.933,P=0.000),表明Raji细胞能在体外形成克隆集落,而NCTD能抑制Raji细胞的这种能力。在lug/mlNCTD直接作用下,14天及21天的Raji细胞集落形成明显受抑,集落形成数降低可达(1.00±1.00)及(2.67±1.15)个/孔。总体上NCTD直接作用组的集落数及集落大小明显小于NCTD预处理组(F=48.945,P=0.000)。NCTD能使Raji细胞发生细胞周期阻滞,Raji细胞经NCTD (0.5ug/ml)作用48小时后,G,/Go期及S期细胞百分数分别减少6.35%、13.23%(t=0.711,P=0.516)(t=1.708,P=0.163),G2/M期细胞百分数增加19.58%(t=-7.227,P=0.002),呈现G2/M期阻滞现象。[结论]1、不同浓度下的NCTD能抑制Raji细胞增殖,具有剂量时间依赖性,但对PBMC既无增殖亦无毒性作用。2、NCTD显著抑制Raji细胞的集落形成能力,对Raji细胞中具有自我更新和增殖潜能的细胞具有抑制克隆形成效应,同时持续平稳的药物浓度增强其抑制效应。3、NCTD对Raji细胞增殖能力的抑制可能与其使Raji细胞产生G2/M期周期阻滞有关。第二部分去甲斑蝥素诱导人Burkitt淋巴瘤Raji细胞株表达免疫激活物激发外周血单个核细胞杀伤活性[目的]探讨IL-2、IL-15激活前后的PBMC杀伤NCTD作用前后Raji细胞的杀伤率的变化及有关杀伤机制的初步探讨。[方法]LDH释放法检测在效靶比分别为10：1、20：1时,500U/ml rhlL-2、20ng/ml rhIL-15激活前后的PBMC对K562细胞的杀伤率,以及NCTD(0.5ug/ml)作用48小时前后Raji细胞被IL-2、IL-15激活前后的PBMC杀伤的杀伤率。流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)检测IL-2、IL-15激活前后PBMC表面的活化性受体NKG2D表达率的变化。FCM检测NCTD (0.5ug/ml)作用48小时前后Raji细胞表面免疫激活物NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表达率的变化。应用SPSS13.0软件进行数据分析,本实验数据资料以均数±标准差(x±s)表示,IL-2、IL-15激活前后的PBMC对K562细胞和Raji细胞杀伤率用析因设计资料的方差分析,激活前后PBMC表面活化性受体NKG2D表达率和NCTD作用前后免疫激活物NKG2D配体的表达率变化使用独立样本t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]在效靶比为10：1、20：1时,未经激活的PBMC对K562细胞的杀伤率只有(15.82±5.12)%和(27.67±3.66)%。但K562细胞被IL-2、IL-15激活的PBMC杀伤的杀伤率分别为(52.42±3.89)%和(79.55±9.22)%,分别提高了36.60%,51.88%(F=168.076,P=0.000)。提示IL-2、IL-15激活的活化PBMC杀伤效应明显优于未经激活的PBMC,活化的PBMC对肿瘤细胞的杀伤具有较高的杀伤活性,可不依赖肿瘤细胞上的MHCI类分子进行杀伤。Raji细胞对未经激活的PBMC存在天然抵抗,未经激活的PBMC在效靶比为10：1、20：1时,对Raji细胞的杀伤率只有(5.04±1.25)%和(8.59±2.19)%,而杀伤经NCTD处理后Raji细胞的杀伤率为(23.63±6.20)%和(41.80±4.09)%,分别增高18.59%、33.21%(F=25.905,P=0.007：F=153.492,P=0.000)。同等条件下,未经NCTD处理的Raji细胞被IL-2、IL-15激活的PBMC杀伤的杀伤率分别为(13.19±3.67)%和(19.89±4.15)%,而杀伤经NCTD作用后的Raji细胞的杀伤率则为(38.97±2.76)%和(63.09±7.30)%,分别增高25.78%、43.54%(F=94.368,P=0.001：F=79.519,P=0.001)。NCTD能明显提高Raji细胞被IL-2、IL-15激活前后的PBMC杀伤的杀伤率(F=285.832,P=0.000),且经过激活的PBMC杀伤效应明显优于未经激活的PBMC (F=61.593,P=0.000)。在最大实验组浓度NCTD作用后的Raji细胞被IL-2、IL-15激活的PBMC杀伤,在效靶比为20：1时,杀伤率可达(63.09±7.30)%。IL-2、IL-15激活后的PBMC表面的活化性受体NKG2D表达率升高19.63%,差异具有统计学意义(t=-3.518,P=0.024)。NCTD (0.5ug/ml)作用48小时后Raji细胞表面ULBP2的表达显著升高11.66%(t=-5.036,P=0.007),余配体的表达无明显变化(P>0.05)。[结论]1、NCTD能明显提高Raji细胞被经IL-2、IL-15激活前后的PBMC杀伤的杀伤率。2、NCTD上调Raji细胞表面免疫激活物ULBP2的表达,激发PBMC的杀伤活性,但对MICA/B及ULBP1、ULBP3的表达的无统计学意义。3、经过激活的PBMC细胞杀伤效应明显提高,机制可能与IL-2、IL-15激活PBMC后表面表达活化性受体NKG2D增高,接受NKG2D的信号传递有关。