论文部分内容阅读
为研究茯砖茶金花菌、发酵过程中微生物群落结构和多样性,本研究对茯砖茶中优势菌进行了初步鉴定；对来自全国产区的茯砖茶优势金花菌进行了菌落形态学特征和孢子显微结构比较；对以形态学特点为基础选取5种类型的优势金花菌进行RAPD多样性分析；以茯砖茶国家定点生产企业湖南茶厂有限公司生产的湘益牌茯砖茶生产线为基础,对茯砖茶渥堆发酵过程、发花中细菌、真菌群落结构和种类进行DGGE分析。主要结果如下：1.采用平板梯度稀释法对金湘益特制礼品茯砖茶中真菌进行了分离纯化和计数,获得2031、2401、3302、4304、5402五株菌株,其中5402为优势菌,达4.97×106个/g茶样,其余为非优势菌,数目相对较少。运用18S rDNA片段序列进行同源比对,结合形态学鉴定方法对其进行鉴定,实验表明菌株2301为Penicillium purpurogenum(产紫青霉)、2401为Penicillium chrysogenum(产黄青霉)、3302为Penicillium sp.(青霉)、4304为Aspergillus sojae(酱油曲霉)、5402为Eurotium herbariorum (蜡叶散囊菌)。2.为研究不同品种茯砖茶中优势金花菌(冠突散囊菌)的形态学多样性,选取从我国湖南、湖北、广西、贵州、浙江、江苏、陕西、新疆八个省份的不同茯砖茶企业生产的茯砖茶样品中分离纯化23株优势金花菌作为供试菌株,从形态特征和显微结构两个方面对各菌株进行初步鉴定,结果发现23株优势金花菌株均属于冠突散囊菌；来自全国不同产区茯砖茶分离的优势金花菌可以分为5种类型：类型Ⅰ包含G3、 G8、G9、G11、G12、G14、G17, G19、G21、G23;类型Ⅱ包含G7、G16；类型Ⅲ包含G13、G15、G20、G22, G24;类型Ⅳ包含G2、G18；类型Ⅴ包含G4、G5、 G6、G10。3.为探究全国各地茯砖茶中优势金花菌的多样性,分别对来自陕西、湖北、广西、湖南生产的茯砖茶中优势金花菌G3、G9、G13、G15、G19进行随机扩增多态DNA(RAPD)研究,结果表明：优势金花菌差异最大为G3和G13,二者遗传距离为最大14,遗传相似系数为最小48.15%；差异最小为G15和G19,二者遗传距离为最小2,遗传相似系数为最大92.59%。说明来自陕西、湖北、广西、湖南等地生产的茯砖茶中优势金花菌存在较为明显的多样性。4.为研究茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构和种类,对渥堆过程中不同时间段细菌16SrDNA的V3可变区进行扩增,对细菌DGGE图谱中条带进行克隆、测序和序列比对。结果表明,黑毛茶在渥堆过程中以渥堆24小时为分界点,前后各自细菌群落结构相似,但前后的差异较大；从16SrDNA的V3可变区比对结果证明黑毛茶渥堆过程中有诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属以及不可培养的ε-变形菌、腐败螺旋菌属、粘球菌属、根瘤菌属和未知分类地位的不可培养细菌六种。5.为研究茯砖茶发花过程中细菌群落结构和种类,对发花过程中不同时段细菌16SrDNA的V3可变区扩增,经变性梯度胶电泳(DGGE)后、对细菌DGGE条带进行克隆、测序和比对。结果表明,在发花过程的第0-4d、6-8d、10-14d茯砖茶发花存在三个差异较大的细菌优势种群结构的演变;从16SrDNA的V3可变区比对结果证明黑毛茶发花发酵过程中有短波单胞菌属、诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、突那梭菌属、韦龙氏假单胞菌属、乳杆菌属、克雷伯氏菌属以及不可培养ε-变形菌、腐败螺旋菌属、粘球菌属、根瘤菌属和六种未知分类地位的不可培养细菌。6.为研究茯砖茶发花过程中真菌群落的结构和种类,对茯砖茶渥堆发酵过程中不同时间段黑毛茶样品中真菌群落的18S rDNA高变区进行扩增,对真菌18S rDNA的DGGE图谱中条带进行回收、克隆、测序和序列比对。结果表明：茯砖茶渥堆发酵过程中真菌类型丰富,有好干性酵母(Wallemia sebi)、假丝酵母菌(Candida sp)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、路德酵母(Lodderomyces sp)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、隐球酵母(Cryptococcus sp)、牧草红酵母(Rhodotorula graminis)阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、白地霉(Galactomyces geotrichum)、安大略假单胞菌(Candida ontarioensis)、真皮毛孢子菌(Trichosporondermatis)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、曲霉(Aspergillus penicillioides);不同渥堆时间段真菌群落结构以渥堆24 h为分界点,前后真菌群落的结构变化较大；真菌群落多样性指数在渥堆0～16 h呈升高趋势,16-24 h略有降低,24 h后继续升高,在渥堆后40 h上升到最高水平2.348,而渥堆>40～48 h仍然维持在较高水平；优势菌路德酵母和汉逊德巴利酵母、次优势菌阿姆斯特丹散囊菌在渥堆整个过程中均有出现,在渥堆后期出现了好干性酵母、汉逊德巴利酵母和酿酒酵母次优势菌；比对结果表明,渥堆中同时存在3株好干性酵母菌和7株阿姆斯特丹散囊菌,说明在渥堆发酵过程中优势菌种内存在多样性。7.为研究茯砖茶发花过程中真菌群落结构和种类,对发花过程中不同时段真群落菌18S rDNA高变区进行扩增,并对真菌变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱中条带进行克隆、测序和序列比对分析。结果发现茯砖茶发花前后时段其优势菌不同,以发花过程的第10d为临界点,0-8 d和10-14 d,前后存在二个差异较大的真菌优势种群结构的演变,10 d前以好干性酵母菌、毕赤酵母、假丝酵母为优势菌,10 d后以阿姆斯特丹散囊菌、好干性酵母菌为优势菌；18S rDNA高变区比对结果证明茯砖茶发花过程中有好干性酵母、汉逊德巴利酵母、酿酒酵母、假丝酵母菌、热带假丝酵母、路德酵母、毕赤酵母、牧草红酵母、隐球酵母、阿姆斯特丹散囊菌、曲霉、毛霉、安大略假单胞菌、真皮毛孢子菌、青霉、白地霉、灰绿曲霉、蜡叶散囊菌等；比对结果也证明存在3株好干性酵母菌和5株阿姆斯特丹散囊菌,说明优势菌种内存在多种亚种或生态型。