较中温脂肪酶而言,耐热脂肪酶具有:较高温度下催化各类化学反应,将提高反应速率、增强反应体系的稳定性、降低反应体系被其他微生物污染的可能性等优点。本课题通过对Burkholderia sp.ZYB002脂肪酶LipA 3D结构全面分析的基础上,利用计算机软件构建LipA的电子突变文库,经筛选后,对部分结构合理、能量小于-0.5 Kcal/mol突变体利用定点突变技术构建出相应的LipA突变体,并对其温度稳定性进行表征。具体实验内容和结果如下:1.利用Castp、Voronoia、Cave等软件分别预测了 LipA分子中存在的空腔以及组成空腔的氨基酸;比较上述三个软件分析出的氨基酸残基组成,对相同位点的氨基酸残基构建突变体电子文库;筛选上述突变体文库(筛选标准:自由能小于-0.5 Kcal/mol和突变前后该位点所处的空腔的体积减少),构建出一个由58个LipA突变体的电子突变体文库。2.进一步深入分析上述58个电子突变体,并挑选出20个电子突变体,利用定点突变技术构建、筛选并表征LipA突变体,最终筛选出2个阳性突变体(LipA-H15P、LipA-A210V),在55 ℃下半衰期较野生型LipA分别提高了9.6倍和2.9倍;对上述两个2个阳性突变体进行叠加突变,最终得到了半衰期较野生型LipA提高了23.1倍的脂肪酶突变体(LipA-H15P/A210V)。3.利用Consurf软件(http://consurf.tau.ac.il)从Clean_Uniprot database数据库中筛选出与LipA多肽序列同源性在30%到95%的蛋白质序列219条,将其中序列相似较大的删除后得到了一个105条序列,将这105条序列构建进化树,从每一个分枝上挑出一条具有代表性的序列并挑选出35条序列与LipA进行同源序列比对,最终筛选出由20个突变体组成的突变文库;经过突变效应分析后,通过定点突变技术,构建了 10个突变体,经酶学性质表征,共筛选2个热稳定性和酶活均有提高的突变体。LipA-L243P和LipA-Y175F的T5012较野生型提高了5℃和1℃,半衰期是野生型的5.7倍和1.8倍。脂肪酶酶活U/OD600是野生型的4.1倍和5.7倍。