目的：Wnt信号与肿瘤的关系一直是国际研究热点。我们前期研究表明Wnt5a在白血病中是一种肿瘤抑制因子；并且Wnt5a与Ror2受体结合，激活非经典Wnt信号，并抑制经典信号及β-catenin的促癌功能。但Wnt5a是通过什么关键分子拮抗经典Wnt信号？它们是否也影响了CML的特效药物Imatinib Mesylate (甲磺酸伊马替尼)对CML的抑制作用？目前国内外均未见报道，值得深入研究。已有报道，在某些细胞中Wnt5a可与细胞膜上Ror2、Fz受体分子结合，并激活JNK，即激活Wnt5a/JNK非经典Wnt信号通路。在CML细胞中，对JNK的研究目前很有限，并有不同的结论：早期的研究认为BCR-ABL激活JNK，并且后者参与了BCR-ABL介导的转化；另一方面，JNK参与了一些化合物诱导BCR-ABL阳性CML细胞凋亡的过程。在CML细胞中，Wnt5a是否可激活JNK，JNK是否参与了Wnt5a对Imatinib Mesylate抗白血病的促进作用？其机制又是什么？这些问题需要我们的进一步证明。γ-catenin是Armadillo蛋白家族（包括α-catenin、β-catenin和γ-catenin）的一个成员，在细胞中它主要参与粘附作用与信号转导。γ-catenin作为Wnt信号通路的一员，它与Wnt5a的关系如何？它是否也参与了Wnt5a对Imatinib Mesylate抗白血病的作用？这些目前国内外均未见报道，值得深入研究。在血液肿瘤中，以前的研究表明，AML(Acute Myeloid Leukemia，急性髓系白血病)融合基因AML1-ETO, PML-RARα和PLZF-RARα所表达的蛋白均可促进γ-catenin的表达，但是CML细胞中的融合基因BCR-ABL所表达的蛋白是否调节γ-catenin的表达还未见报道。Kim等的研究发现：相对于CML慢性期的病人，加速期与急变期的病例中γ-catenin高表达，提示γ-catenin在CML中可能发挥重要作用，但确切的作用及其机制尚需深入研究。本研究在前期研究的基础上，以解决以下几个问题为目的：1．Wnt5a是否可通过激活JNK影响Imatinib Mesylate的抗白血病作用？2．γ-catenin是否可以被Wnt5a调节？3. γ-catenin是否可以被BCR-ABL调节，并且在CML中发挥什么作用？并且γ-catenin是否也能够影响Imatinib Mesylate的抗白血病作用？研究结果有助于深入认识Wnt5a/JNK与γ-catenin在白血病中的作用及机制，为临床治疗CML提供新的策略。方法：1. Wnt5a通过JNK影响Imatinib Mesylate抑制CML细胞作用及其机制研究。1.1构建过表达Wnt5a的细胞株(KU812-Wnt5a)；Wnt5a在CML细胞中对β-catenin及其下游基因Survivin表达的影响，以及对γ-catenin表达水平的影响；检测过表达Wnt5a对Imatinib Mesylate抑制CML细胞株(K562，KU812)的影响(抑制CML细胞增殖，诱导CML细胞凋亡，抑制BCR-ABL表达及活性)。1.2检测过表达Wnt5a对JNK表达及其活性(磷酸化水平)的影响；JNK受到抑制后Wnt5a对β-catenin/Survivin表达的影响；使用JNK抑制剂SP600125抑制JNK活性，然后检测Imatinib Mesylate抑制细胞株K562-Wnt5a、KU812-Wnt5a的变化。1.3构建过表达JNK1与JNK2的CML细胞株，检测JNK对Imatinib Mesylate抑制CML细胞株的影响，以及对β-catenin及其下游基因Survivin表达的影响，以及对γ-catenin表达水平的影响。1.4构建K562细胞NOD/SCID鼠移植瘤模型；检测Wnt5a在体内对ImatinibMesylate抑制成瘤生长的影响以及对BCR-ABL表达的影响。2．γ-catenin在CML中作用的研究2.1检测不同白血病细胞株中γ-catenin的表达情况；构建BCR-ABL siRNA的CML细胞株，检测BCR-ABL对γ-catenin表达的影响；用免疫共沉淀的方法检测蛋白BCR-ABL与γ-catenin的相互作用。2.2构建γ-catenin siRNA的CML细胞株；检测γ-catenin受到抑制后CML细胞增殖及克隆形成的变化，以及细胞增殖有关的基因cycliD1及c-Myc表达的变化。2.3检测抑制γ-catenin对Imatinib Mesylate抑制CML细胞株(抑制增殖，诱导凋亡)的影响，以及基因Survivin、Bcl-xL表达的变化。2.4检测γ-catenin受到抑制后核转录因子STAT5磷酸化水平的变化，β-catenin表达水平及磷酸化水平以及核转位情况，以及Wnt信号中调节β-catenin的关键分子GSK3β及其磷酸化水平的变化。结果：1. Wnt5a/JNK信号通路促进了Imatinib Mesylate对CML细胞的抑制作用；并且Wnt5a可以抑制γ-catenin的表达，但并不是通过JNK。1.1在过表达Wnt5a的细胞株中发现：Wnt5a抑制了β-catenin及其下游基因Survivin,也抑制了γ-catenin的表达；Wnt5a可促进Imatinib Mesylate对CML细胞株增殖的抑制，增强其诱导凋亡的能力，并促进Imatinib Mesylate抑制BCR-ABL融合基因表达及抑制其活性的能力。1.2Wnt5a对JNK表达水平无影响，但能活化JNK(磷酸化水平升高)；用JNK抑制剂SP600125抑制JNK活性后，削弱了Wnt5a对Imatinib Mesylate抗白血病的增强作用，也削弱了Wnt5a对β-catenin及其下游基因Survivin的抑制。1.3在过表达JNK1与JNK2的CML细胞株中发现：JNK促进了对Imatinib Mesylate抑制CML细胞株的作用；JNK1/JNK2均抑制了β-catenin及其下游基因Survivin，但对γ-catenin没有影响。1.4成功构建K562细胞NOD/SCID鼠移植瘤模型；Wnt5a在体内增强了ImatinibMesylate对移植瘤生长和BCR-ABL表达的抑制。2. γ-catenin在CML中作用的研究2.1在7个白血病细胞株中，γ-catenin只在K562、KU812两个CML细胞中表达；构建成功BCR-ABL siRNA的CML细胞株，并且发现BCR-ABL表达下降后γ-catenin表达也下降；免疫共沉淀结果显示BCR-ABL蛋白与γ-catenin并未像BCR-ABL与β-catenin一样相互结合。2.2构建成功γ-catenin siRNA的CML细胞株；并且发现抑制γ-catenin时，CML细胞增殖减慢，克隆形成能力也降低，与细胞增殖有关的基因cyclinD1及c-Myc表达均下降。2.3抑制γ-catenin后，Imatinib Mesylate对CML细胞株的抑制作用(抑制增殖，诱导凋亡)增强；凋亡相关基因Survivin、Bcl-xL表达下降。2.4抑制γ-catenin后核转录因子STAT5磷酸化水平下降；GSK3β表达水平上升，而磷酸化水平下降；总β-catenin表达水平无明显变化，但其磷酸化水平升高，且核内β-catenin蛋白水平下降。结论：1.在CML中，Wnt5a可活化JNK，并通过JNK促进药物Imatinib Mesylate的作用，其机制与其抑制β-catenin及其下游基因Survivin表达有关。Wnt5a还能抑制Wnt相关分子γ-catenin，但与JNK无关，该作用也是Wnt5a增强Imatinib Mesylate抑制CML的作用机制之一。2.在CML中，γ-catenin高表达，这与BCR-ABL上调γ-catenin有关，这种调节不是二者直接结合的方式。下调γ-catenin可明显抑制CML细胞增殖和克隆形成并促进Imatinib Mesylate抗CML细胞的作用，这些作用与γ-catenin通过GSK3β/β-catenin和转录因子STAT5,上调下游基因cyclin D1、c-Myc、Survivin和Bcl-xL表达有关，表明γ-catenin在CML中是一个促癌因子。