长期腹膜透析可导致腹膜结构的改变,导致腹膜透析相关性腹膜纤维化综合症的发生,制约了腹膜透析的应用和发展,其已成为困扰腹膜透析患者及其研究者的一个重要难题。因此,如何延缓甚至阻断腹膜纤维化进程,是本研究领域的一个重要热点。血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的重要组成成分之一。目前研究表明,腹膜间皮细胞能合成与分泌AngⅡ,腹膜局部产生的AngⅡ作为一种重要的生长因子,在调节腹膜间皮细胞的增殖、凋亡以及纤维化进程中起重要作用。AngⅡ可以引起腹膜间皮细胞E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子(transforming growth factor, TGF-β1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogenactivator inhibitor-1, PAI-1)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)等多种因子的表达异常。研究证实,AngⅡ参与了腹膜间皮细胞的转分化和细胞外基质的积聚,与腹膜纤维化的发生发展密切相关。腹膜透析液的生物不相容因素,致腹膜间皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation, EMT), EMT是发生腹膜纤维化早期病变的关键,转分化而来的肌纤维母细胞是参与腹膜纤维化的主要细胞。有研究证实,高糖环境导致腹膜发生氧化应激促进了EMT发生。细胞外基质的过度积聚可能由两方面因素引起：一是细胞外基质的产生过多,二是细胞外基质的降解减少。细胞外基质降解蛋白酶主要包括：丝氨酸蛋白酶类(PA/PAI),基质蛋白酶(MMPs/TIMP),其中PA是纤溶系统的关键酶系,是纤溶酶原转化成纤溶酶的催化剂,PA的活性受PAI-1,2,3的调控,其中PAI-1最重要。活性氧(reactive oxygen species, ROS)是由氧激发的化学性质十分活泼的分子,近年来,其作为信号传递分子之一,在腹膜纤维化进程中的作用受到越来越多的关注。高糖腹膜透析液引起腹膜组织的氧化应激已被认为是导致腹膜结构和功能改变的始动因素。同时,腹膜局部的血管紧张素Ⅱ也是引起腹膜氧化应激反应的最强刺激之一。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶是一种过氧化物酶,广泛存在于吞噬细胞及非吞噬细胞,其催化产物ROS参与机体防御和信息传递等许多生理过程。NADPH氧化酶主要由5个亚基组成,包括：2个膜亚基gp91phox, P22phox;3个胞浆亚基P47phox, P40pox, P67phox。另外,还有2个低分子量的GTP结合蛋白Rap1A和rac2。当细胞受到相应刺激后,胞浆亚基P47phox被磷酸化激活,与P67phox结合并向胞膜转位,与胞膜亚基结合组成有氧化活性的复合体,将氧催化为‘O2,进而产生一系列活性氧,造成细胞损伤。NADPH氧化酶作为ROS的调控酶,其胞浆亚基p47phox在腹膜的氧化应激反应中起着始动、枢纽性作用。色谱指纹图谱证实黄芪注射液(astragalus intervention, AGI)有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰,超微结构证实AGI能拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤。因此,从分子生物学角度探讨AGI能否延缓腹膜纤维化的发生发展十分必要。本研究应用AngⅡ刺激腹膜间皮细胞,以探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA和蛋白表达的影响、及对转分化相关因子等表达的影响,及AGI干预作用,为腹膜纤维化防治提供新的思路。1 AngⅡ对腹膜问皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及AGI的干预作用1.1目的探讨AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响,及二代腹膜间皮细胞经AGI预处理后的干预作用。1.2方法采用腹腔注射胰蛋白酶法,分离培养大鼠腹膜间皮细胞(rat peritoneal mesothelial cells, RPMCs),体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至二代,静止24h后,随机分为：正常对照组)A组),AngⅡ(10-7mol/L)组(B组),AngⅡ+AGI(2g/m1)组(C组),AngⅡ+AGI(1g/ml)组(D组)。荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内ROS。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚基p47phox的表达。Wester印迹检测p47phox的蛋白表达。1.3结果(1) AngⅡ可显著增加大鼠腹膜间皮细胞ROS产生,刺激20min后,ROS的表达较对照组显著上升(P<0.05)。AGI可显著抑制AngⅡ刺激后ROS的产生,且AGI对ROS的抑制程度与AGI的浓度呈正相关,B组、C组、D组三组比较差异显著(P<0.05)；(2) RPMCs经AngⅡ刺激后,NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA和蛋白的表达均上升AGI可抑制AngⅡ诱导的p47phox表达上调,C、D两组分别与B组比较具有显著性差异(P<0.05)。1.4结论AngⅡ可诱导RPMCs产生的ROS增加、NADPH氧化酶亚基p47phox表达上调。AGI制NADPH氧化酶的表达和活性及ROS的产生。2 AngⅡ诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化及AGI的干预作用2.1目的探讨AngⅡ诱导RPMCs转分化,及二代腹膜间皮细胞经AGI预处理后的干预作用。2.2方法体外培养SD大鼠原代RPMCs至二代,静止24 h后,随机分为4组：正常对照组,AngⅡ(10-7mol/L)组,AngⅡ+AGI(2g/mL)组和AngⅡ+AGI(1g/mL)组。AngⅡ(10-7mol/L)组给予AngⅡ(10-7mol/L)体外刺激RPMCs。AngⅡ+AGI (2g/mL)组和AngⅡ+AGI(1g/mL)组分别用AGI(2g/ml), AGI(1g/ml)预处理1h后,再行AngⅡ(10-7mol/L)体外刺激RPMCs。实时定量RT-PCR法测定α-SMA、E-Cadherin mRNA的表达；Western印迹法测定α-SMA、E-Cadherinm蛋白的表达。基因表达在8h,蛋白表达在24h分别观察以上各组基因和蛋白的表达水平。2.3结果：(1)AngⅡ可诱导腹膜间皮细胞转分化标志因子α-SMAmRNA和蛋白水平表达上调,二者均P<0.05。经AGI预处理后可抑制由AngⅡ诱导的α-SMA表达上调,使α-SMAmRNA和蛋白水平均降低,二者均P<0.05,未观察到AGI对α-SMAmRNA和蛋白水平的抑制程度与AGI的浓度呈正相关。(2) AngⅡ可诱导E-Cadherin mRNA的表达下调,AGI可以显著逆转这种表达的下调,差异有统计学意义(P<0.05)。亦未观察到AGI对E-Cadherin mRNA表达的影响与AGI的浓度有关。2.4结论黄芪对腹膜间皮细胞向间充质细胞转分化过程有抑制作用。3 AngⅡ对腹膜间皮细胞PAI-1表达的影响以及AGI的干预作用3.1目的探讨AngⅡ对RPMCs纤溶酶原激活物抑制物PAI-1表达的影响,及二代腹膜间皮细胞经AGI预处理后的干预作用。3.2方法采用腹腔注射胰蛋白酶法,分离培养RPMCs,体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至二代,静止24h后,随机分为：正常对照组(A组),AngⅡ(10-7mol/L)组(B组),AngⅡ+AGI(2g/ml)组(C组)AngⅡ+AGI(1g/ml)组(D组)。B组：用AngⅡ(10-7M)体外刺激RPMCs,检测0,2h,4h,8h,12h,24h基因水平的变化。C组和D组：分别用AGI(2g/ml)、AGI(1g/ml)预处理后,再行AngⅡ(10-7M)体外刺激RPMCs,基因水平在8h,蛋白水平在24h观察以上各组各指标的变化情况。3.3结果(1) AngⅡ以时间依赖方式诱导PAI-1 mRNA表达上调,从2h开始,持续至12 h,以4h为高峰,为Oh的3.51±0.18倍(P<0.05),AngⅡ可诱导腹膜间皮细胞中PAI-1蛋白表达上调,以24 h为高峰,为Oh的1.69±0.16倍(P<0.05)。(2)4h时AGI使PAI-1的mRNA下降了39.43%(C组),37.28%(D组),差异显著(P<0.05)；24h时AGI使PAI-1的蛋白水平下降了29.41%(C组),24.12%(D组),差异显著(P<0.05)。未观察到AGI对PAI-1的mRNA和蛋白的抑制程度依赖于AGI浓度,即C组与D组比较(P>0.05)。3.4结论AGI通过抑制PAI-1的表达,减少腹膜间皮细胞外基质的过度积聚来延缓腹膜纤维化的发生与发展。4 AngⅡ对腹膜问皮细胞TGF-β1表达的影响以及AGI的干预作用4.1目的观察AngⅡ对RPMCs转化生长因子TGF-β1表达的影响,及二代腹膜间皮细胞经AGI预处理后的干预作用。4.2方法取第2代RPMC(经细胞形态和免疫组化鉴定),随机分为4组,A组即对照组DMEM/F12培养基培养；B组：DMEM/F12培养基中加入AngⅡ(10-7mol/L)组；C组：DMEM/F12培养基中加入AngⅡ(10-7mol/L)+AGI(2g/ml)组;D组：DMEM/F12培养基中加入AngⅡ(10-7mol/L)+AGI(1g/ml)组。培养24h收集细胞提取RNA,48h收集细胞提取蛋白,RT-PCR检测腹膜间皮细胞’TGF-β1 mRNA的表达。Western印迹检测TGF-β1的蛋白表达。4.3结果(1)RPMCs经AngⅡ(10-7mol/L)后,TGF-pl mRNA和蛋白的表达均上升,与0h比较,TGF-P1 mRNA和蛋白的表达分别于24h、48h时达到高峰,A、B两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)AGI可显著抑制AngⅡ(10-7mol/L)刺激腹膜间皮细胞TGF-β1 mRNA和蛋白的表达上调,24h时,AGI使TGF-β1 mRNA的表达下降明显,B组分别为：A组的2.50倍、C组的2.12倍、D组的1.68倍,D组为C组的1.25倍。48h时,AGI使TGF-β1的蛋白水平下降明显,B组分别为：A组的1.85倍、C组的1.51倍、D组的1.24倍,D组为C组的1.22倍。C、D两组分别与B组比较差异有统计学意义(P<0.05),且抑制程度与AGI浓度呈正相关,即C、D两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。4.4结论AGI抑制腹膜纤维化的中枢性因子TGF-β1 mRNA和蛋白表达的活性是其延缓腹膜纤维化发生发展重要机制之一5 AngⅡ对腹膜间皮细胞MCP-1达的影响及AGI的干预作用5.1目的观察AngⅡ对RPMCs单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) mRNA和蛋白表达的影响,及二代腹膜间皮细胞经AGI预处理后的干预作用。5.2方法采用腹腔注射胰蛋白酶法,分离培养RPMCs,体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞至二代,静止24h后,随机分为：正常对照组(A组),AngⅡ(10-7mol/L)组(B组),AngⅡ+AGI(2g/ml)组(C组),AngⅡ+AGI(1g/ml)组(D组)。B组：用AngⅡ(10-7M)体外刺激RPMCs, RT-PCR法检测各组各时间点MCP-1 mRNA的表达；Western blot法检测各组各时间点MCP-1的蛋白表达。5.3结果(1) AngⅡ刺激RPMCs,4小时后可诱导MCP-1 mRNA的表达上调,AGI预处理可显著抑制这种上调,与AngⅡ组相比,AGI低浓度组和高浓度组分别使MCP-1 mRNA表达降低了15.6%和49.9%(P<0.05),而且对MCP-1 mRNA表达的抑制程度与其浓度呈正相关,4组与3组比较(P<0.05)。(2) AngⅡ刺激RPMCs,8小时后可诱导MCP-1蛋白的表达上调,黄芪预处理可显著抑制这种上调,与AngⅡ组相比,AGI低浓度组和高浓度组分别使MCP-1蛋白表达降低了17.6%和43.7%(P<0.05),而且对MCP-1蛋白表达的抑制程度与其浓度呈正相关,即4组与3组比较(P<0.05)。5.4结论AGI延缓腹膜纤维化发生发展的临床作用,与其抑制腹膜间皮细胞中MCP-1基因及蛋白的过度表达有关。总结(1) AngⅡ可诱导RPMCs ROS产生增加以及NADPH氧化酶亚基p47phox的表达升高,AGI可显著抑制由AngⅡ诱导的RPMCs ROS产生增加及NADPH氧化酶亚基p47phox的表达升高,该实验提示AGI可减轻由AngⅡ诱导的RPMCs氧化应激损伤。(2) AngⅡ可诱导RPMCsα-SMA、PAI-1、TGF-β1、MCP-1 mRNA和蛋白表达上调及E-Cadherin mRNA表达下调,AGI可显著抑制由AngⅡ诱导的RPMCsα-SMA、PAI-1、TGF-β1、MCP-1 mRNA和蛋白表达上调及E-Cadherin mRNA表达下调,这些因子与腹膜间皮细胞转分化、细胞外基质积聚的发生关系密切,该实验提示AGI可通过抑制以上因子表达的异常,阻断或延缓腹膜间皮细胞转分化、细胞外基质积聚的发生,从而延缓腹膜纤维化的发生与发展。创新点(1)目前,虽然经色谱指纹图谱证实AGI有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰,但在腹膜组织中,AGI清除自由基、抗氧化作用与NADPH氧化酶亚基p47phox、ROS之间的对话如何?还没见报道,该研究提示AGI可通过下调p47phox的表达、减少ROS的产生,从而减轻]RPMCs氧化应激损伤。(2)虽然AGI与RPMCs TGF-β1mRNA和蛋白表达之间对话的研究已有报道,但AGI与RPMCsα-SMA、PAI-1、MCP-1 mRNA和蛋白表达及E-Cadherin mRNA表达之间对话的研究罕有报道。该研究表明：通过AGI干预后,AGI可阻止腹膜间皮细胞向间充质细胞转分化；并通过加速细胞外基质的降解、减轻炎症反应,从而减少细胞外基质过度积聚。