目的:脑恶性胶质瘤起源于神经胶质细胞,是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,约占全部脑肿瘤的50～60%。胶质瘤患者症状发展快,危害严重,不易控制及治疗,是危害人类健康的重要杀手。目前,脑胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗和综合治疗等,尽管近年来上述治疗措施已取得长足进步,但由于胶质瘤呈浸润性生长,与周围脑组织无明显分界且易于复发,疗效均不甚理想,尤其是高度恶性的胶质瘤,在临床治疗中经常会出现对放疗的不敏感或对化疗的耐药性,导致临床治疗效果不佳,预后差。因此,胶质瘤的治疗一直是神经外科最棘手的问题之一。对胶质瘤生物特性研究的不断深入,寻找调控胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子靶标,明确其在胶质瘤发病过程中的病理机制,将有助于寻找新的、肿瘤类型特异性的治疗策略,这已成为神经外科领域的研究热点之一。细胞膜离子通道以其主要通过的离子可分为钾、钠、氯、钙通道。离子通道的开放可引起细胞内相应离子浓度的变化,这种变化引起细胞的各种生理病理活动。但每类通道因其电流特性不同又可分为多个亚型,每型通道的门控方式和调控模式各有不同。不同类型细胞中相同类型的离子通道其分布密度、通道特性、调控方式及功能作用也有差别,甚至截然相反。在胶质瘤细胞中,离子通道有特殊重要的作用,研究表明,钾通道的活动与瘤细胞的增殖与侵袭有关,钠通道的活动与肿瘤细胞的分裂有关,氯通道介导的细胞变形作用对胶质瘤侵袭至关重要。鉴于离子通道在细胞增殖中的重要作用,而胶质瘤细胞又具备高度增殖的能力,那么在分子水平寻找新的抗肿瘤方法可以将离子通道作为靶向目标。对胶质瘤细胞上离子通道的特性及调控研究将有助于揭示胶质瘤细胞病理生理变化机制,为寻找新的治疗手段提供重要的理论依据。国外已经进行了多种胶质瘤细胞株生物特性及膜上离子通道的特性及调控研究。国内也进行了一些药物对胶质瘤细胞增殖分化影响的研究。研究发现,常用于乳腺癌治疗的雌激素受体竞争性拮抗剂他莫昔芬对胶质瘤的治疗有效。体外试验证明他莫昔芬可以抑制胶质瘤增殖及迁移。但是它的作用机制复杂,并且还没有被彻底阐明。新的研究发现,他莫昔芬对多种离子通道有调控作用,这可能是其抗瘤作用机制之一,但其对胶质瘤细胞膜上离子通道调控的方式及机制还不清楚,有待我们阐明。c-fos基因是即刻早期基因的重要成员,其编码蛋白是真核细胞内重要的转录因子,可诱导下游报道基因mRNA的转录和蛋白表达,参与细胞增殖和凋亡调控。c-fos基因表达异常增加可干扰细胞增殖和凋亡的动态平衡,诱导细胞转化和肿瘤形成。对它的调控可改变肿瘤细胞增殖特性。其调控方式复杂,PKC在其中起重要作用。揭示其调控机制对抗癌防癌有重要意义。人恶性胶质瘤细胞株,SHG-44经常被用于各种研究,其生物学性状稳定、易于培养。但是,人们对其基因调控、细胞膜上离子通道的特性及调控等方面所做的研究还鲜有报道。鉴于SHG-44细胞株上膜离子通道及c-fos基因表达调控对肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、凋亡等重要生物学特性具备的重要意义,进行了此研究。研究共分三个部分。第一部分他莫昔芬对SHG-44人胶质瘤细胞的增殖抑制作用研究方法:1、复苏并培养SHG-44胶质瘤细胞。显微镜观察应用不同浓度他莫昔芬后SHG-44细胞生长情况及形态的变化。2、免疫组化检测细胞PKCα及ER表达。结果判断:PKC阳性为SHG-44细胞的细胞质中出现棕黄色染色,ER阳性:SHG-44细胞的细胞核中出现棕黄色染色。3、以MTT法检测应用浓度依次为0、2、4、6、8、10、15μmol/L的他莫昔芬培养1~3d后SHG-44细胞的生存率。4、以流式细胞仪检测应用浓度为0、2、4、6μmol/L的他莫昔芬培养2d后SHG-44细胞的凋亡情况及细胞周期情况。5、运用统计软件spss12.0对结果进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用q检验。结果: 1、SHG-44细胞株在DMEM培养液中生长良好,在倒置显微镜下可见细胞呈长梭形,核异形性常见。细胞的冻存与复苏对细胞生物学特性没有影响。加入他莫昔芬后,细胞折光性变弱,轮廓增强,突起减少,胞质中出现大量颗粒,细胞之间的间隙明显增大,细胞变老,脱落,生长受到抑制。正常对照细胞生长良好。2、加入PKCα抗体的SHG-44细胞的细胞质中出现棕黄色染色,提示细胞中含有PKC,而加入ER抗体的细胞中未出现染色,提示SHG-44细胞中无ER成分。3、MTT试验显示:应用不同浓度他莫昔芬作用后测量各培养孔的吸光值,与空白对照组相比,他莫昔芬使细胞的吸光值明显下降。再计算细胞的抑制率,结果显示,随着他莫昔芬从2μmol/L上升至10μmol/L,SHG-44细胞的抑制率也明显增加,但超过10μmol/L,则抑制率的变化就不够显著。同一药物浓度下,48h组的细胞抑制率明显高于24h组,但与48h组相比较,在72h组中只有6μmol/L组的抑制率增加了。4、流式细胞仪检测显示:与空白对照组相比,SHG-44细胞经过他莫昔芬作用后,G0/G1期细胞比例减少,G2/M期及S期细胞比例增多,细胞阻滞于G2/M期及S期。细胞凋亡检测显示:与空白对照相比,应用他莫昔芬组凋亡细胞比例增高,并且随着作用剂量的增加,凋亡细胞比例有增多的趋势。第二部分SHG-44人胶质瘤细胞离子通道特性及他莫昔芬调控研究方法:1、培养SHG-44胶质瘤细胞,试验前,以0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA消化,制成细胞悬液,接种于预先放置盖玻片含无血清培养基的培养板中,经过48小时后可进行膜片钳记录。应用全细胞膜片钳方式记录SHG-44细胞膜上的钠通道、内向整流钾通道及氯离子通道电流,细胞破膜后5min开始记录。2、绘制各离子通道的电流密度–电压关系(I–V)曲线。观察施用不同浓度他莫昔芬后各离子通道的I-V曲线及峰值电流密度的变化。3、以I/Imax为纵坐标,以他莫昔芬浓度为横坐标,绘制各通道药物作用的量效关系散点图,以Origin 7.5软件行Hill拟合,求出他莫昔芬抑制各离子通道的半数抑制浓度(IC50)值。4、以标准化后的电导值对测试电压脉冲作图。以Origin 7.5软件行Boltzmann拟合,绘出对照组及各处理组钠、钾、氯通道的激活曲线,求出通道的半数激活电压(V1/2)及斜率(k)值,并观察不同浓度的他莫昔芬对它们的影响。5、比较空白组及加入他莫昔芬、PKC抑制剂、PKC激活剂、他莫昔芬+PKC抑制剂各处理组之间的氯离子通道电流变化情况,以分析他莫昔芬对通道的影响是否与抑制PKC活性有关及其程度。他莫昔芬浓度为1.5μmol/L ,PKC抑制剂为100nmol/L十字孢碱(staurosporine),PKC激活剂为1μmol/L 12-佛波醇脂(PMA)。6、应用SPSS 12软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(χ-±s)表示,首先进行组间均衡性检验,两组计量资料采用t检验或配对t检验,成组资料间比较采用配伍组分析,以P<0.05为有显著性差异的标准。结果:1、SHG-44细胞膜钠通道电流表现为快速激活和快速失活特性,电流幅值-254±176pA。激活阈电压约-30mV。1μmol/L的TTX可完全阻断此电流。其半数激活电压V1/2是-29.3±3.5mV,斜率k=3.56±0.41。在钳制电压为0mV时,2μmol/L、6μmol/L及8μmol/L tmx对钠电流抑制率分别为27.3±3.1%、57.1±5.8%及70.9±8.2%,其半数抑制浓度(IC50)为5.54±0.46μmol/L,但并不改变通道的开放动力学特性。2、内向整流钾通道电流表现为快速激活和缓慢的失活,电流幅值为-375±76pA,该电流有明显的内向整流特性,其V1/2=-75.32±5.4mV,k=12.26±1.3。在钳制电压为-140mV时,2μmol/L、6μmol/L及8μmol/L tmx对电流的抑制率分别为38.7±4.1%、69.4±6.1%、78.7±7.2%,其IC50为2.84±0.31μmol/L。并且使激活曲线右移,应用8μmol/L tmx后通道的V1/2=-54.95±4.8mV,k=16.17±1.8,与对照组相比有显著差异。3、氯通道电流为快速激活,不失活,并且表现出明显的外向整流特性,电流幅值平均为-2030±1956pA,其V1/2是34.14±3.2mV,k=20.59±2.3。向细胞外液中加入浓度分别为0μmol/L、2μmol/L、8μmol/L的他莫昔芬后,在钳制电压为+100mV时,2μmol/L、8μmol/L他莫昔芬对氯电流抑制率分别为67.1±7.1%。89.7±8.8%。其半数抑制浓度为1.34±0.22μmol/L。并且使激活曲线右移。应用8μmol/L tmx后通道的V1/2是59.66±5.5mV,k=18.06±2.2。4、向细胞外液中加入1.5μmol/L他莫昔芬后,氯电流幅度明显降低,膜电位为+100mV时,其抑制率为48±5.6%。如向细胞外液中加入PKC激酶抑制剂十字孢碱100nmol/L,电流幅度抑制42±4.8%,如先加入十字孢碱100nmol/L,再加入tamoxifen 1.5μmol/L,电流幅度抑制39±5.3%,与仅加入十字孢碱组相比电流仅下降7.1%。而单独向细胞外液中加入PKC激活剂12-佛波醇脂1μmol/L,可使氯通道电流幅度增加36±4.1%。第三部分他莫昔芬对SHG-44人胶质瘤细胞c-fos基因表达的影响方法:培养SHG-44胶质瘤细胞,以终浓度依次为0、2、6、8μmol/L他莫昔芬培养2d,提取各组总RNA,将提取的总RNA,在1.5%琼脂糖凝胶中电泳30分钟后,将凝胶移至紫外透射仪下进行观察,判断其完整性。将提取的总RNA进行反转录为cDNA。利用DNA结合染色荧光定量PCR技术对SHG-44细胞的c-fos原癌基因与内参照β-actin基因cDNA进行定量扩增。采用比较Ct法计算结果,以明确不同浓度的他莫昔芬抑制c-fos基因表达的程度。结果:应用0、2、6、8μmol/L他莫昔芬各组的c-fos基因表达的Ct值分别为17.14、18.48、19.8、20.55,β-actin Ct值分别为18.01、17.62、18.81、17.42。应用2、6、8μmol/L他莫昔芬各组c-fos基因的沉默效率分别为0.7、0.72、0.94。结论:1、SHG-44细胞有PKC表达,无ER表达。他莫昔芬可抑制细胞增殖,这种抑制作用具有时间和药物浓度依赖性,但有一定的作用时间和药物浓度范围,这种抑制作用可能与抑制PKC活性有关。2、他莫昔芬可使SHG-44细胞阻滞于G2/M期及S期,并使凋亡细胞比例增高。他莫昔芬对SHG-44细胞的抑制作用与对其它肿瘤细胞的抑制有所不同。3、SHG-44细胞上有电压依赖性的钠通道表达。其电生理特性与其它肿瘤细胞的钠通道有所不同。他莫昔芬可浓度依赖性的抑制此钠通道电流,其半数抑制浓度(IC50)为5.54μmol/L,但并不改变通道的开放动力学特性。4、SHG-44细胞上有内向钾通道电流表达。该通道具有明显的内向整流特性。他莫昔芬可浓度依赖性的抑制此钾通道电流,半数抑制浓度为2.84μmol/L。并且改变其激活动力学。使V1/2向去极化的方向移动,使通道变的不易激活。5、SHG-44细胞上有氯通道表达,其电流有外向整流特性。他莫昔芬可浓度依赖性的抑制此氯通道电流,半数抑制浓度1.34μmol/L。并使V1/2向去极化的方向移动,使通道变的不易激活。氯通道对他莫昔芬的敏感性最高。6、他莫昔芬对SHG-44细胞上离子通道电流的抑制主要是通过抑制PKC对通道蛋白的磷酸化实现的。SHG-44人胶质瘤细胞上离子通道特性及调控与多种其它肿瘤细胞上的离子通道有显著区别。7、他莫昔芬可使SHG-44胶质瘤细胞的c-fos基因表达水平下降,且这种抑制作用呈浓度依赖性,这种作用是可能是通过对PKC的抑制实现的。8、他莫昔芬抑制SHG-44细胞增殖、促进凋亡与抑制细胞膜上的离子通道活性、下调c-fos基因表达有关,PKC在其中起重要的介导作用。