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量子点是一种三维尺度均小于100 nm的特殊纳米材料,具有宽激发窄发射、荧光量子产率高、光稳定性好、荧光寿命长等优点,在生物医学领域有着重要的应用前景。然而,由于量子点的重金属元素组成及其纳米尺寸效应,量子点的生物安全性问题不容忽视。与量子点相关技术的快速发展相比,量子点的生物安全性研究明显滞后。目前,关于量子点的生物安全性依然无法得到统一的结论,相关研究中依然存在诸多问题,如缺乏标准化的研究方法和评价体系,量子点的细胞毒性机制、量子点在生物体中的代谢及其二次生物学效应等尚无定论。为了解决这些问题,有必要开拓新的研究思路和研究方法,对量子点的生物安全性进行系统深入研究。金属组学主要通过高效的分离手段(高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳和凝胶电泳等)和高灵敏的检测手段(电感耦合等离子体质谱、电喷雾电离质谱和基质辅助激光解析电离质谱等)相结合的联用技术,来研究生物体内金属元素的含量、分布、形态、结构和生物功能等。由于量子点的金属元素组成,金属组学非常适合于量子点的生物安全性研究。基于金属组学的研究思路和研究方法,能够获得量子点在生物体中的含量、分布、形态及其转变等信息,了解其与生物分子之间的相互作用,有助于从分子水平上揭示量子点引发细胞毒性的机理。可以预料,金属组学将为量子点的生物安全性研究提供重要的技术平台。然而,据我们所知,到目前为止,有关金属组学用于量子点生物安全性研究的报道甚少。基于此,本论文的研究目的是:利用金属组学的研究思路和方法,对CdSe/ZnS量子点的生物安全性进行初步研究;采用质谱联用技术和生化分析方法研究量子点的细胞生物动力学行为(吸收、分布和清除)及其毒性;采用基于质谱的联用技术和相关分析技术对量子点在细胞中的存在形态及其随培育条件的变化情况进行考察;通过高分辨质谱鉴定量子点存在形态的具体结构信息,为从分子水平上揭示量子点引发的细胞毒性机理提供技术平台和基础数据。本论文的主要内容包括:(1)采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和生化分析方法,系统研究了CdSe/ZnS量子点的细胞吸收、清除及其对HepG2细胞的毒性。ICP-MS的结果表明,HepG2细胞对CdSe/ZnS量子点的吸收有别于Cd(Ⅱ)和Se(Ⅳ),吸收率较低并表现出浓度依赖性和时间饱和性。量子点的吸收与其本身的物理化学性质(粒径、功能基)密切相关,粒径更小的氨基量子点更易进入细胞。采用生化分析方法评价了CdSe/ZnS、Cd(II)和Se(Ⅳ)对HepG2细胞的毒性。Cd(Ⅱ)在8.9 μM浓度下会对HepG2细胞造成显著的毒性;但是,在10-100 nM浓度范围内,四种CdSe/ZnS量子点没有对HepG2细胞产生明显的毒性作用。然而,量子点(100 nM)引发细胞分子水平的变化,细胞应激反应相关的MT1A基因和CYP1A1基因的表达水平都显著上调,并且上调程度与胞内量子点的含量呈正相关。因此,CdSe/ZnS量子点的健康风险仍存在,还需进一步研究。(2)采用尺寸排阻色谱与ICP-MS的联用技术(SEC-ICP-MS)研究了四种CdSe/ZnS量子点在HepG2细胞中的存在形态。从ICP-MS测定Cd的结果可以看出,CdSe/ZnS量子点在细胞中以两种形态(QD-1和QD-2)存在。通过保留时间比较、透射电镜表征和荧光检测等方法,证明QD-1是一种类似量子点的纳米颗粒。通过反相高效液相色谱和ICP-MS及电喷雾四极杆飞行时间串联质谱同时联用方法(RPLC-ICP-MS/ESI-QTOF-MS),证明QD-2是一类含有Cd的金属硫蛋白(Cd-MTs)。同时,考察了培育条件对量子点存在形态的影响。不同培育条件(培育时间、培育浓度和清除时间)下,量子点在细胞中都主要以QD-1和QD-2两种形态存在。而且,QD-1和QD-2的含量随着培育浓度和培育时间的增加而增加。这部分工作为从分子水平上揭示量子点的细胞毒性机理提供了新思路。(3)进一步改进了RPLC-ICP-MS/ESI-QTOF-MS同时联用方法,通过优化RPLC的梯度洗脱程序实现了不同MTs亚型异构体之间的高效分离。用改进的RPLC-ICP-MS/ESI-Q-TOF-MS联用方法研究了QD-2的具体形态组成。ICP-MS测定的结果说明,QD-2包含4组形态,分别是Peak1、Peak2、Peak3和Peak4。 ESI-Q-TOF-MS的结果表明,Peakl-Peak4分别是不同摩尔比的Cd/Zn与不同亚型MTs结合形成的Cd,Zn-MTs。其中,Peakl-Peak4依次对应的MTs是:乙酰化的MT2a(N Ac-MT2a)、乙酰化的MT1e(N Ac-MT1e)、乙酰化的MT1g(N Ac-MT1g)和MTlm。同时,考察了培育条件对QD-2具体组成的影响。不同的培育条件(培育时间、培育浓度和清除时间)下,QD-2在细胞中都包含Peakl-Peak4四组形态。而且,Peakl-Peak4的含量随着培育浓度和培育时间的增加而增加。但是,Peakl-Peak4包含的形态个数,即不同摩尔比的Cd/Zn结合的Cd,Zn-MTs个数,随着培育浓度和培育时间的增加而增加。这部分工作进一步揭示了Cd从CdSe/ZnS量子点中释放出来后,在细胞中的存在形态及其变化情况,有助于深入探讨和阐明量子点在细胞中的代谢及其毒性机理。